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分子生物学实验小技巧集锦丨助你一臂之力

继上周推出分子生物学实验方法集锦(没看过的请点击http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=9474524)后,收到很多同学的留言。很多正在通往“大牛”路上的同学希望管家哥写下实验小技巧方面的文章,能让自己的实验之路少走些弯路。今天,管家哥结合实验“大牛”们给的建议和自身经验,整理些分子生物实验方面的小技巧,希望对你们有帮助。
也欢迎实验“大牛”们继续给管家哥留言分享你们的实验小技巧,师弟师妹们等着你们哦!

平时实验没有做成功,不一定是设计方案有问题,而往往是由于操作上面的不认真,或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验,与大家分享(注意:实验需要靠自己摸索,下面的经验如果对你有启发的,切记先小试验证):

1. 提取质粒的时候,最后一步的酒精挥发很关键,基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间,最好是空调吹热风,或是37度温箱放长一点的时间,我试过室温过夜,酶切很好。
2. 有关缓冲液和培养基配置
1)将缓冲液配方中的成分分别以10-100倍配成母液储存,需要的时候只需将相应的母液混合,补加水稀释即可
2)配培养基时通常会忘记各成分的量,如配LB时的三个成分不记得到底哪个是5g,哪个要10个,因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量,如配LB时,在NaCl瓶外注明10g/L,yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等,很方便,不需要每次配之前临时翻书。
3. 有关PCR主反应液配置:
在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定,每次配置PCR反应液很繁琐,可以将其配置类似kit的形式,按你需要的反应体系列表,然后放大100倍配置100×主反应液(100次反应),其中含buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和Taq酶,然后可以10×分装或一管储存在-20度,在需要的时候拿出融开,然后按所需的PCR反应个数吸取相应的倍数,再补加相应反应倍数的Taq和引物,混匀后分装,这样做的好处如下:
1)可极大的节省宝贵的时间,可早点收工,看球
2)避免每次反应加样不均的可能
3)大大减少PCR假阳性的产生
4. 有关酶切反应液的配置:
在做酶切时,也可以像PCR一样配置主反应液,每次反应前先列好反应的体系,算好需要的反应数,然后按所需反应的体系按所需反应数放大,加入buffer、酶、水;质粒栏空缺,然后混合后按除质粒DNA的体积分装,然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切,这样做的好处如下,特别是当同时有10几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显:
1)各反应成分均一
2)可大大减少限制型内切酶的使用
3)节省时间
5. 做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果先用8MUrea重悬细菌再煮效果会有极大改善.
注:不能用Gu-HCl代替
6. 超滤最合适用于蛋白的浓缩,更换缓冲液和除盐,对于按照分子量进行初分离的效果不是很好,理论和现实是有很大差别的^_^
7. 我们有时要沉淀东西时,由于沉淀量很少,离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西,所以离心时建议按特定的方向放置离心管(比如EP管盖放同一方向),这样你就可以在离心之前确定沉淀的大致部位。另外看沉淀时可以对光看,这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。
8. 大家都知道PMSF有剧毒,以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积,到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。(就是说让你改变溶剂体积,配合质量,使最终浓度不变)
9. 在用酶标板加样的时候,蛋白样品常常会产生很多气泡,如果做荧光实验,由于灵敏度非常高,一点点微小的气泡都会影响很大,常常又不可能加消泡剂,我就用卫生纸,撕下来一小条,搓成小针,碰一碰气泡就破了,很好使。(管家哥提示也可以准备一个小针头,打火机稍微加热,碰一下气泡即破,一般一次加热可以搓好几个。如果体系可以离心,就瞬间离心下最好)
10. 酶切或者PCR体系混合好以后,大家都会用手指轻弹EP管的底部来混匀溶液,常常出现很多气泡。这时候轻弹液面上方的管壁,消除气泡就轻而易举了。千万别弹液面下方的,气泡会越来越多。
11. 磁珠回收时,不要贪多,收集上层即可,太过影响DNA的纯度和质量,对链接、转化有影响。
12. 各种buffer都要完全融化后才能用,而且不管什么药品,如果只剩下最后一点底子了,最好放弃,因为可能会影响你的实验。
13. 动手前,一定要思路清晰,尽量把要做的事情列出来。
14. 做前一定要在笔记上写上1、2、3.....,在按照笔记一步一步做,否则容易出错。(管家哥想说这点师弟师妹应该做的很好的吧,哈哈)
15. 要加的酶阿,dNTP,水啊之类的能分装的话最好分装好一点,万一污染的话就全完了。(管家哥提醒这点非常重要)
16. 制备好了一批感受态,最好马上转化一种已知质粒,与此同时,取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒,又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格,那以后就可以放心使用!
17. 做克隆挑斑时,我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前,在一块相应抗性的平板上点一下,标注清楚,培养时间稍长一点,待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷,又可以保证菌的一致。
18. 抽提质粒时,加入SloutionII和III后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样,只要不是非常剧烈,可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候,这样可以快速,而且效果一点也不差。
19. 抽提质粒时,用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定,如果时间充裕可以30min,否则8-10min也可以。至于温度,个人觉得-20度好于常温。如果加入可醋酸钠,会较容易形成盐类杂质,所以时间短一些更好!
20. 不知道大家都是怎么做酶切的,我的体会是,酶切质粒时,两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多(管家哥提醒这个要视不同体系而定)。我有一次双酶切两次都没连出来,后来分步单酶切,连接效率几乎100%。
可以第一个酶切完后直接把体系热失活,(根据酶说明书上一般是65度20min)然后直接向里面补第二个酶
或者第一个切完后用氯仿抽提,把蛋白提出
或者中间做一次回收,这个就要考虑回收效率和损失的问题了,但是这样除蛋白最彻底
21. 任何试剂反复冻融对其效率都有很大地影响。所以买来的试剂第一次使用时要注意按每次实验用量分装保存。提取的模板或纯化的样品也最好分装保存,以备不测。

在大家的留言中,涉及最多的就是关于蛋白电泳方面(爱之深责之切啊),管家哥单独列出来:

1. 跑page胶的时候,小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些,且分离效果更高,有利于分子量相差不大的蛋白分离。
2. 做WESTERNBLOT 的时候,大家往往会摸索一抗、二抗的浓度,封闭时间,曝光时间等等,而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜,甚至重新提蛋白,这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后,将PVDF膜晾干,裁减成小块,保存起来,用的时候取出一块,没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说,节约了大量的时间。
3. 可将SDS-PAGE的积层胶,分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱(注:10%AP,TEMED不加,切记!!!),每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP,TEMED即可,没必要每次制胶时候翻分子克隆,特别方便,而且,这样的预制胶可储存半年以上,不失为偷懒的绝佳方法;更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触,因此大大减少中毒的机会。
4. 电泳时虽然小电泳分离效果要好一些,但2小时以上的等待的时间实在是痛苦,因此可以提高电泳至150V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热,这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差,关键是时间大大节省,不需1h即可看结果了。
5. 做SDS-PAGE的时候,除了蛋白量上样一致,最好体积也一致,这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽,方便后面的比较,特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致,否则跑出来会有的宽有的窄,特别是上样体积相差较大的。
6. 在把蛋白胶做成干胶时,很多时候会因为有气泡使胶裂掉,我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了,还有就是高温烘胶(管家哥提醒慎用),我喜欢放到60度烘箱里烘,这样水分蒸发速度快,即使有一些小的气泡也不会有影响,呵呵,这是经验之谈,我从来都没失手过,大家可以试试。
7. 做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要>1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期。
8. 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面。
9. 做westernblotting 转膜时,胶放在转膜缓冲液中一段时间,待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装好转膜装置,我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带,方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚,等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了,以防maker失去参照价值。
10. 器具的清洁非常重要,开始做前,为了安全,尤其是装胶的厚薄玻璃板,可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗,确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗2-3遍,然后用去离子水冲洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干备用。
11. 配胶最好现用现配,先配下层胶(分离胶),后配上层胶(浓缩胶或积层胶),而且在临灌胶前加APS并迅速混匀,即用移液枪抽吸与注入1-2次即可。(管家哥提醒,有条件最好现配现用,如果是配好板子的,也最好尽快在2天内使用,同时保鲜膜注意密封好。)
12. 跑蛋白page的时候,一开始用加样针,太麻烦,发现用20ul枪+普通小白枪头点样,非常省事。另外,点样时有可能看不清孔在哪,看远离你的那面胶,孔有反光的。点样也点你对面的那块胶,省的总低头,干咱这行的容易得颈椎呀,爱惜自己。
13. 垂直电泳时,可在电泳糟中放入青霉素小瓶等,可自然使液面提高而不影响电泳,又很节约电泳缓冲液。(管家哥没试过,慎用)
14. 配胶时不要反复用枪混,稍微摇混就可以了,用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。
15. AP分装成500微升一管保存放-20度,避免AP用太久失效。
16. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干,因为微量的水存在会影响配的胶浓度。
17. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板,在一平皿里装好水,把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来,一点没有问题,方便的很。
18. 点样时样品别忘了离心这步,因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。
今天就先到这里!如果你想了解更多实验方面的信息,欢迎私信楼主。最近正在整理细胞生物学实验集锦,敬请期待。

大家平时做实验,肯定都有很多小的技巧,在书上都看不到的,也没有系统的整理,但是确实能够起到很好的作用,不妨在这里与大家分享一下。

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用户评论

感谢楼主分享,分子小白学习了!

阅后留言,好帖子不能沉哈:D

包涵体和2×SDS混合煮沸会变成可溶吗?

楼主辛苦,经验细节很重要

还未开始试验 但是楼主的帖子给了我莫大的力量!

楼主有没有做过蛋白质的非变性电泳

7楼: Originally posted by 爱意李艾 at 2015-11-05 17:01:41
楼主有没有做过蛋白质的非变性电泳
你是想要protocol还是有问题?

亲,我想问问你知道试管摇不起来菌的原因吗?我们现在做实验,加不加抗生素都摇不起来菌

在跑SDS-PAGE时,什么时候调电压合适呢?我在跑到中间的时候从60v调到80v,好像影响挺大的。

多谢分享!

我想问一下如果质粒单酶切加的酶量不足,是否可以直接往体系里加酶,还是需要把之前的酶处理掉再加酶

给新手带来许多有价值的信息,非常感谢~~送花儿

想问下每次pcr胶回收时候检测都没有条带,是胶回收都损失了吗,之后酶切连接也不顺利

:victory::cry:

楼主,想问一下,拔出梳子就可以直接加样,还是覆盖一层水再加???

好帖子,顶一个~

适合我们实验室小白:D

24楼: Originally posted by 不随波逐流 at 2016-04-11 20:35:08
楼主,想问一下,拔出梳子就可以直接加样,还是覆盖一层水再加???
可以直接加,也可以放进电泳槽后再加,都可以的,看你自己的习惯

楼主棒棒哒棒棒哒??分子小白学习了!

马克一下:D

求问楼主,农杆菌提取质粒质量很好,但是跑胶并没有条带,可能是什么原因?:cry:

7楼: Originally posted by 爱意李艾 at 2015-11-05 17:01:41
楼主有没有做过蛋白质的非变性电泳
这个我即将也要做native

感谢楼主,好人一生平安:hand::hand::hand:

写得太好了!研一新生表示看后受益匪浅:hand:

请问AP培养基(Arginine Phosphate medium),可有配方,能否发一份?以前没有做过,查文献寻找好久都没有找到。

好帖 不注意细节后悔莫及啊

感谢(??ω`?)

学习了,多谢多谢:D

很棒,谢谢分享!

楼主,你就是圣诞老爷爷

我想问下,最近我提的质粒,纯度有2.1或2.2了,还能继续转农杆菌吗?还有这两天保的甘油农杆菌有的小摇不起来,有的小摇能摇起来,大摇就不行了,不知道什么原因,有什么解决方法吗?

谢谢楼主,楼主辛苦啦。有个问题想请教您一下,我的蛋白分子量很小,大概小于3.5KD,多次跑SDS蛋白胶均以失败告终。我用的是12%的分离胶,5%的浓缩胶

楼主有木有做水稻bifc  co-ip  的protocol啊,麻烦发一份,邮箱1216982089@qq.com。谢谢。


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