小弟博一，最近养MC3T3-E1成骨细胞，有诸多不懂问题，向各位大神请教，望大神过路时，留步指点一下迷津，希望大神回答问题的同时能给出文献依据或者稍作解释，让小弟多学习一些东西。

1、关于ALP活性的检测
     小弟以10 000个/孔的细胞密度接种于48孔板，采用培养基(10mM的β-甘油磷酸钠+50ug/ml的抗坏血酸），用以表征一种蛋白质对于细胞ALP活性的影响。分别检测了第三天，第五天的结果，实验结果该种蛋白明显抑制细胞ALP活性。但是，第六天茜素红染色的结果显示，该种蛋白质又能够促进细胞的体外矿化。实验组红色非常明显，但是对照组红色很浅。
      因此小弟非常不解，为何该种蛋白抑制ALP活性，同时又能够促进细胞体外矿化。查文献说可能是其促进细胞分化的作用较强，导致所检测时间点观测不到ALP峰值。于是，小弟又重复了一遍实验，测了一下第二天的ALP活性，结果是实验组和对照组没有明显区别，并且ALP活性值都较低。
      所以，小弟想请教一下，我以上的实验步骤中，有哪些步骤有问题或者可以改进？或者说某位大神能够帮助我解释一下我所得到的实验结果，为何抑制ALP活性，反而促进体外矿化？我应该如何进一步设计实验呢？是否有方法能够测到ALP表达的峰值？即实验组高于对照组的。

2、关于ALP实验方法
     小弟每个实验组都取了48孔板上的6个孔作为重复，是否有必要设置如此多的重复组呢，但是我测出来这些重复组之间的误差还挺大。我如果采用6孔板养细胞，每个实验组设置一个孔，检测ALP时，将每个孔中的裂解液分别取三次测其ALP活性再求统计，是否有意义呢？

3、关于茜素红染色
      小弟阅读的文献上得知茜素红染色是与钙离子反应，红色代表有钙结节生成，但是这种体外矿化的钙结节是否就是羟基磷灰石呢？小弟做了一下EDS，证明这种钙结节中确实还有Ca、P、O元素。是否有必要用TEM选区电子衍射表征一下这种钙结节的物相，之前是否有文献有过相关报道？

4、关于RT-PCR
     小弟希望通过RT-PCR的手段表征一下，该种蛋白对于细胞各种成骨分化特异性基因的作用，如Runx2、Col-II、OCN、OPN等等。请问细胞培养的话，需要使用多少孔板，接种多少细胞，培养多长周期？

     先提出这些疑问吧，请大神指点迷津! 返回小木虫查看更多