1．2．l 用于染色体研究的软组织的处理
    室温下将全部或部分样品浸入0．9％的生理盐水中，在数分钟内将样品送至实验室，最迟也要在1～2 小时之内送到。
    研究染色体能看到有丝分裂和减数分裂，从而了解有关染色体倒位等现象。染色体倒位会影响到受精和遗传重组，可能的同性个体应从染色体方面进行检查，但对哺乳动物来说，通常不需要研究同性别的染色体。




1．2．2 用于成纤维细胞培养的组织的处理
    通常来源于幼体动物的组织用于细胞培养较好。在一个个体中，癌组织和肺组织是最好的，但其他软组织也可以用。
    细胞培养常用的是新鲜组织，但捕杀几天后的动物组织仍能用来培养。总之，样品越快到实验室，成功的可能性就越大。
    如果取样时需切开活体动物的皮肤，则应当在无菌的条件下进行。对细胞培养来说，无菌条件下进行进一步的处理也是很有必要的，而在野外这是难以做到的。因此，一个不透风的封闭空间以及面具、手套是很有用的，至少操作人员应离开工作台面远一些。所有的台面、试剂瓶、手套、仪器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的试剂应是新鲜的，如果对其无菌性有任何怀疑（如变浑浊或变颜色）就应倒掉。

    在无菌条件下将组织样品放入0％的酒精中，摇动1 分钟后，将样品转人收集液中，在室温下放置1～4 天。如需放置更长时间，则两天后须将组织样品转到运输液中，就可再于室温下存放几天。转移过程中无菌操作是很重要的，因为运输液中一般不使用防腐剂。
    收集液和运输液一般由接受样品的实验室提供。成纤维细胞培养可生产出更多的材料而不必再从动物中取，达到事半功倍的效果。




1．2．3 用于染色体研究的血样的采集
    采血样须无菌操作。采血用的注射器、小瓶等应用肝素润湿。有些用品买来时就已经用肝素处理过。迅速将血样送往实验室（在低温条件下但不使其冻结）。如果条件不允许，可在无菌条件下，每 0．lml 血样加 5ml 的血样处理液，然后在室温下转送到实验室（实验室会有另一种准备好的处理液）。


1．2．4 用于酶及其他蛋白质研究的软组织的处理
    将软组织切成1cm 见方的小块，包好并迅速冻存。如将组织块浸泡在2％的苯甲醛中，在室温下放置，某些酶的活性可保持几个月（Nakanishi 等1969）。一些鱼类蛋白质可以用市场买来的材料进行分析，但这里的目的是区分种，而不是为了获得详尽的遗传数据。




1．2．5 用于酶和蛋白质研究的血样的采集
    试验所用的注射器、试管等应用肝素包被（最好是锂盐），或者是用低温保存的肝素润湿。如果可能的话，所有溶液配制等操作均应在5℃条件下快速完成。对于较大体积的样品（＞5ml），最好将红细胞、白细胞、血浆分开。首先在1000r／min 离心10 分钟，快速吸取血浆，迅速分装冻存。然后吸出漂浮在红细胞表面的一层白细胞带，再用5～10 倍体积的PBS 将红细胞洗两次后离心，最后将片状沉淀物快速冻存。
    白细胞层用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化铵、0．01mol／dm３ 碳酸氢钾、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到变成澄清的红色（约 5 分钟）。在 500r／min 离心 5 分钟后，小心吸去 ACK 和红细胞碎片，剩下的白细胞会重新悬浮于 ACK 中。2 分钟后，细胞成团沉淀，此时再用 PBS 洗。如果沉淀物仍为红色，则将整个过程重复一次，而后将其冻存。白细胞（酶的最好来源）也可以通过将等分血样铺展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分钟），再用巴氏吸管从界面吸取白细胞，于1000r／min 离心10 分钟，而后冻存。用 Ficoll 分离的红细胞很难再复原。
    有些蛋白质可以用其他方式保存的血样进行分析：①保存于5℃并在几小时内送到实验室的；②冻存的全血（未处理过）；③全血或经分离的血样稀释于3 倍体积的苯甲醛中，并保存于室温下。蛋白质电泳是用于研究种群内遗传多样性或分类学差异的方法。同其他脊椎动物相比，哺乳动物血样并非是很好的酶和蛋白质的来源，有时取软组织更好。


1．2．6 用于核DNA 研究的软组织的保存
    将组织切成1cm 见方的小块，包起来冻存。或将其放入几倍体积的80％乙醇（分析纯）中，于4℃下存放。两种方法中以前一种方法更好。

1．2．7 用于核DNA 研究的血样的保存保存血样可用占血样体积0．01 倍的15％ K２EDTA 作为抗凝剂，并且最好能够加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸级，Boehringer Mannheim 冰冻保存，用新解冻的），充分混合后迅速冻存。血与EDTA 混合液可在室温下放置几天，但DNA 的质量不会太好。
    DNA 技术可以分析几乎所有组织样品基因组的任何一部分，从而能够克服用蛋白质研 究变异及分类学时出现的有关问题。

1．2．8 用于制备DNA 的毛发及精子样品的保存
    虽然以前从干燥或用福尔马林固定的毛发及精子样品中提取过DNA，但最可靠的保存方法是冻存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必须注意的一点是，尽可能地减少其他来源的DNA 对样品的污染，特别是实验者的手，因为PCR 反应对微量DNA 是很敏感的。较好的做法是仪器经烘烤（180℃过夜）或火焰消毒，其他所用的每一件东西（手套、试管、工作台面）最好用一套新的、经γ射线消毒处理的商业化产品。精子样品也可以用来作常规的遗传分析，如不需要人工控制交配就可进行连锁研究（Li 等1988）。当然，精子样品还可用于人工授精，这在圈养动物的遗传管理上是很重要的。

1．2．9 用于提取线粒体DNA 的软组织及血样的保存
    最好将样品在4℃下保存，并尽快送到实验室。血样贮存于有葡萄糖柠檬酸包被的真空管中时，可以冻存几年（最好在液氮中），但解冻后只能在室温下保存几天时间。线粒体DNA 的分析对研究物种在地理分布上的变异及构建谱系尤其有用。

1．2．10 用于提供RNA 的软组织的保存
    RNA 会在极短的时间内被破坏，因此必须在动物死亡或活检后1～2 分钟内迅速将其切成1cm 的小块，并放人液氮中冻存。
    RNA 可用于 DNA 文库的构建，它能为遗传学家提供探针，用于个体总DNA 中单个活性基因的分析。虽然来源于其他动物的探针也能用，但用同种的探针效果最好。

2 动物组织DNA 样品的提取
    目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我们在这一部分中除了介绍常规的DNA提取方法外，还将着重讨论由微量样品（如毛发）和陈旧古老样品提取DNA 的一些新方法。

2．1提取动物总DNA 的常规方法
    从动物组织中提取DNA 的常规步骤如下：
（1）取动物组织100mg 左右于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎。
（2）在样品管中加入如下试剂：
500μl STE 溶液
25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml）
75μl 10％ SDS
（3）混匀后置56℃下消化2 小时以上（隔一定时间混匀一次）。
（4）加人等体积的饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5 分钟以上（用于rDNA 和RAPD 分析的样品需抽提24 小时）。
（5）7 000r／min 离心5 分钟。
（6）小心将上层清液移至另一干净的离心管中，加入等体积的苯酚及氯仿，并重复步骤（4）和（5）的抽提过程。
（7）以等体积的氯仿（内含1／25 体积的异戊醇）重复步骤（4）和（5）的抽提过程。
（8）在上清液中加入 1／10 体积的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍体积的冷无水乙醇或1 倍体积的异丙醇，以沉淀DNA。
（9）置—70℃下沉淀2 小时或置—20℃下沉淀过夜。
（10）7 000r／min 离心10 分钟，再以 70％冷乙醇洗涤DNA 沉淀一次。将沉淀置真空干燥器或37℃温箱中干燥。
（11）以适量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 样品。
（12）以分光光度计测定DNA 的浓度（260nm），260／280nm 的光密度比值应在 1．8 以上，否则提示可能有蛋白质或苯酚的污染。
（13）以TE 溶液将DNA 样品稀释成所需的工作液的浓度。
（14）取2μl 左右的样品进行电泳检测，以判断 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。


2．2 微量动物组织样品的总DNA 提取方法
    从微量组织中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）发展起来的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一种螯合剂）提取DNA。此方法简便、快速，提取后的DNA 样品可以直接作为PCR 的模板。具体的操作步骤如下：
（1）取一小块冰冻的组织（少于1mg，可用经消毒的枪头钻取），或1～3 根带有毛根的毛发（需先经 90％、70％的乙醇和灭菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入经过高温消毒的离心管中。离心管内事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。
（2）将样品管在56℃下放置1 小时或更长时间，直至组织样品成粉末状（不同组织所需时间各不相同）。
（3）在振荡器上振荡10～15 秒钟。
（4）在 95～100℃下煮 15～40 分钟。
（5）在振荡器上振荡10～15 秒钟。
（6）将样品管在4℃下保存，进行PCR 反应之前再次离心，使Chelex 颗粒沉淀。取上清液（1～10μl）作为DNA 模板。

2．3 陈旧、古老DNA 样品的提取方法
    对于陈旧、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段首次从古埃及木乃伊中提取并测定了一段DNA 序列。然而，较为广泛地开展对古老DNA 的研究是在多酶链式聚合反应（PCR）发明以后才开始的（Mullis，Fallona 1987）。
    经过一定时期的物理、化学作用（几十年至几百万年）的DNA 往往存在比较严重的降解，DNA 片段常常仅有几百个bp 的长度，并且可能存在碱基的修饰和一些抑制PCR 反应的物质。因此，在从陈旧或古老样品中提取DNA 时，最为关键的问题就是防止现代DNA 的污染。进行DNA 提取操作的所有器皿、器械和试剂均要进行灭菌处理，提取过程应在超净台中进行。此外，提取时应设阴性对照，以监测是否存在外源DNA 的污染。下面介绍的是一种较为简便的提取方法。
（1）取样品少许（如哺乳动物的皮张可取 1cm × 1cm 见方的小块），用剪刀、手术刀等器械对样品表面进行处理，除去最容易遭受外来污染的表层。对于骨骼、琥珀等坚硬的样品则需要用小钢钻等特殊器械从内部取得样品。
（2）经过表面处理的样品用90％乙醇、70％乙醇和去离子水依次进行清洗。
（3）在灭菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去离子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 体积的（20μl）10％的β-巯琉基乙醇。处理过的样品放入上述溶液前要尽可能剪碎。
（4）在56℃下消化48 小时。
（5）样品管中加入等体积的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋涡混合器上振荡5～10秒钟，然后在98℃下放置20～60 分钟。
（6）振荡混合5～10 秒钟，并使之冷却至室温。
（7）12 000r／min 离心 5～10 分钟。
（8）小心取出上层清液，置另一干净的管中保存。

3 植物总DNA 的提取
    1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分离了植物DNA，然而这些DNA 是不能用于克隆的。在发明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人们可用分离动物组织DNA 的方法分离植物DNA。去除植物带电高分子污染物的方法有核分离（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）分离（Murray，Thompson 1980）和盐酸／十二烷基肌氨酸钠分离（Sung，Slightom 1981）等。在这些方法中，CTAB 方法因简便、快速而使用最广泛。收集和保存植物组织的方法对于 DNA 的产量和质量也有很大影响。虽然已能成功地从植物标本和化石中分离出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鲜材料能产生最好的结果，特别是对于产生大量单宁、酚或其他次级代谢产物的种。如材料不能马上进行提取，应保存在冷而湿的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷冻保存。如果没有条件，最好在无水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取应尽快进行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。
    提取DNA 的过程中有许多因素能导致DNA 降解。首先是物理因素。因为DNA 分子量较大，机械张力或高温很容易使DNA 分子发生断裂。因此，在实际操作过程中应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移及剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA 的损伤，同时也应避免过高的温度。其次，细胞内源DNA 酶及细胞破裂释放的次级产物也会导致DNA 降解。所以在提取DNA 的实验中，设计了许多可供选择的分离缓冲液，以适应不同的植物材料。分离缓冲液的pH 值有时需要进行改进，pH 应避免接近降解酶的最适点。大多数降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最适点在 5．0～6．0 之间，而DNA 酶pH 值最适点在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在过酸的条件下，DNA 脱嘌呤会导致DNA 的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂，所以大多植物DNA 提取缓冲液的pH 值为8．0，有的甚至为9．0。缓冲液中包含了大量的复合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸钠）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇（DTT）、抗坏血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸盐（DEPC）、溴化乙锭（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物质有些是抑制内切酶和非特异性核酸酶的，所以在其后的步骤中要将其除去。分离DNA 与蛋白质一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿对蛋白质均有极强的变性作用，而对DNA 无影响。下面的方法描述DNA 与污染物多糖的分离，也可用阴离子交换层析仪来进行。下面列出了3 种常见的分离植物总DNA 的方法。3 种方法溶解细胞膜和分离蛋白质的方法不同，各有其优、缺点。

3．1 CTAB 缓冲液方法
    这是最广泛地用来分离植物DNA 的方法，对大多数植物种都适用，特别是当样本数量很小时。此法运用阳离子去污剂CTAB 溶解植物细胞膜，并与DNA 形成一复合物。其优点是不需要准备大量的植物组织，而且适合像叶、根、种子、胚、胚乳、花粉和悬浮培养的组织等多种类型的组织（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法对样品数量的要求也不高，从小到毫克数量的标本（木乃伊、化石）到许多克的新鲜材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。



3．1．1 CTAB 的实验方法
1．材料
（1）2 倍CTAB 缓冲液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0
1．4mol／dm３NaCI
20 mmol／dm３EDTA
2％ CTAB（W／V）
1％ PVP-360（W／V）
0．2％ß-巯基乙醇（体积比，用前在通风橱中加）
（2）清洗缓冲液：
76％乙醇
10 mmol／dm３乙酸铵
（3）悬浮缓冲液：
10 mmol／dm３乙酸铵
0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8．



2．步骤
（1）加热分离缓冲液、研钵、研杵到60℃。
（2）在热研钵中放人0．5～1．5g 新鲜或冰冻的叶子，用7．5ml 2 倍CTAB 分离缓冲液研磨（可加些石英砂帮助研磨）。对冻干的组织用1 倍CTAB 缓冲液研磨。把研碎的组织倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 缓冲液冲洗研钵，将冲洗液加到管中。
（3）将试管在60℃下放置30～60 分钟，然后轻轻振荡，使之充分混合后降至室温。
（4）在试管中加入10ml 氯仿－异戊醇（24:1）萃取液（如颜色深可再进行一次），轻轻摇晃使其混合，在室温下1500r／min 离心5 分钟，使其分相。
（5）将上层的水相倒入－15ml 管中，加2／3 体积的冷异丙醇，轻轻混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分钟或更长时间。
（6）室温下 800r／min 离心 3～5 分钟，如果看不到小团或沉淀，可在－20℃下放置 20分钟再离心。
（7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，这时的核酸一般松散地贴在管的底部，加 15ml清洗缓冲液，轻轻地旋转清洗沉淀物，15～20 分钟后核酸将变得更白。
（8）室温下800r／min 离心5 分钟（如不充分，则加大离心速度或延长离心时间），倒掉清洗缓冲液，将管倒扣在纸巾上，让沉淀物干燥，小心不要让DNA 滑掉。
（9）按沉淀物的大小用少量悬浮缓冲液（10～100 μl）悬浮DNA。
（l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下温育 30～60 分钟。
（11）如果组织包含单宁或其他次级产物，可以对 DNA 作进一步纯化（可用氯仿、苯酚纯化）。一些材料可能需要用氯铯（CsCl）梯度纯化。上述方法也可以进行改进，像巯基乙醇的浓度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗坏血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作悬浮缓冲液。



3．1．2 CTAB 沉淀法
1．材料
2 倍CTAB 分离缓冲液；沉淀缓冲液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。
2．步骤
（1）与7．3．1．1 中前4 个步骤同。
（2）吸取上层水相，将其例入一个15ml 管中。
（3）加 3 倍体积的沉淀缓冲液，使NaCI 的浓度减少到 0．35mol／dm３，室温下放置 30分钟。
（4）室温下 2 000r／min 离心 5 分钟，以沉淀 DNA。
（5）根据沉淀物的大小，用少量的悬浮缓冲液（10～100μl）悬浮DNA。
（6）虽然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是对那些包含单宁或其他次级产物的组织，可以在氯化铯梯度上进一步纯化。




3．2 蛋白质沉淀方法
    这个方法可以产生高质量的DNA，但产量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸钾沉淀蛋白质和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有机提取，而且快速，所以对大量样品比较合适。

1．材料
    提取缓冲液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巯基乙醇（体积比），用之前在通风橱中加。
2．步骤
（1）用液氮在研钵中研磨1．0g 新鲜叶子，可以加一些石英砂帮助研磨。将研磨完毕的粉末贮存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要让植物材料融化。
（2）在冰冻的组织中加 6ml 提取缓冲液，转到一个15ml 的离心管中，充分振荡大约30 秒钟，使之混合均匀，然后在65℃下放置20 分钟。
（3）往管中加入2ml 5mol／dm３乙酸钾（pH 值6．5），充分摇匀，在冰水中放置5 分钟。随着不溶的十二烷基硫酸钾的沉淀，大部分蛋白质和多糖作为复合物被除去了。
（4）在 4℃下 2 000r／min 离心 20 分钟。
（5）吸出上清液，将其倒入一个干净的 15ml 的离心管中，不要带入颗粒物质，然后加 4ml 异丙醇轻轻混合，在－20℃下放置。
（6）在4℃下 2 000r／min 离心 15 秒钟，DNA 沉淀后，轻轻地倒掉上清液，在纸巾上倒扣10 分钟或更长时间，以干燥沉淀物。
（7）将沉淀物放在 100TE 中溶解，然后将溶液倒入一个1．sml 离心管中，离心 5分钟，移去不溶的沉淀。
（8）将管中上清液倒入另一个 1．5ml 离心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷异丙醇，充分混合，在-20℃下放置1～2 小时，拿出后再在室温下放10 秒钟，使管中DNA 沉淀。
（9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分钟，离心 1 分钟，干燥沉淀物 10 分钟。
（10）根据DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。




3．3 氯化铯方法
    这个方法的原理是根据在氯化铯（CsCl）中的不同密度梯度来分离细胞成分。此方法可以产生大量高纯度的DNA，但费时，而且需昂贵的仪器设备，对需要复杂的有机提取或沉淀的材料比较适合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情况下，它可能是在含大量次级产物的植物中提取高质量DNA 的唯一方法。DNA 可以在一个平衡的CsCl 梯度中通过与以下几个染料中的一个结合而被纯化， 这几个染料为溴化乙锭（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙锭（propidium iodide）、Bisbenzimide，它们不同的



3．4 PCR 小量制备法
    此方法的优点是一次可以提纯很多样品，比较快速，而且小于10mg（50mm）的新鲜叶子材料就可以产生足够的DNA，产生的DNA 对杂交实验是可用的（Millgan 1992）。这个方法存在的问题是DNA 沉淀物可能不够紧密，或不一定能形成一紧密的DNA 沉淀。
1. 材料
    分离缓冲液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３NaCI；25 mmol／dm３EDTA；0．5 ％ SDS。
2．步骤
（1）用1．5ml 离心管研磨小的组织样品。可取管口大小的新鲜叶子（＜10mg），冻在液氮中的叶子也可用。
（2）在研碎的样品中加 400μl 的分离缓冲液，用适合的速度涡旋 10 秒钟，以分散开样品。
（3）在室温下将1．5ml 离心管中样品离心 12～15 分钟，沉淀细胞内物质。
（4）搜集300μl 的上清液，弃去沉淀。
（5）在上清液中加300μl 预冷异丙醇，倒转样品1～3 次，使之充分混合，在室温下至少放置5 分钟。
（6）将微离心管中的样品在室温下离心20 分钟，以搜集沉淀的DNA。
（7）弃去上清液，用300μl 80％的乙醇室温下沉淀 10 分钟。
（8）室温下离心样品12 分钟，弃去上清液。
（9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室温下离心 5 分钟，弃去上清液。
（10）室温下干燥样品1 小时或将样品放过夜。
（11）用 100μl TE 悬浮样品，

不错，值得关注下

很不错的帖子！我现在也在做鱼类肌肉组织DNA的提取，不过样品是浸泡在福尔马林中保存的，实验前期处理比较复杂，出来的结果不是很好，有明显拖带现象，请问有没有好的实验方法？