RT-PCR老出不来,是RNA质量问题吗?
本人最近在做RT-PCR,提取的RNA 5s条带总是很亮,是不是降解了啊?还有就是用之前在DNA上P出来的引物在RNA上P,结果出来的结果很奇怪,上下游引物互换,扩增出来的片段测序为18s 核糖体RNA的部分片段,不是我要的目的片段;换引物重做,又在别人的文献里找了个内参基因,但我不知道这个内参基因是什么,结果我的目的片段没出来,内参基因出来了,这是不是就说明我的RNA质量没问题啊?本人愚见,如果内参也是扩核糖体RNA的话,会不会是总RNA中mRNA的质量很少或降解了,所以以rRNA为模板就能扩出来,以mRNA为模板就扩不出来啊?第一张图是我提的RNA,第二张图中很亮的带就是内参基因扩出来的。请各位大侠帮我分析一下啊?
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自己先顶一下啊,急等高人指教!
5S的亮度已经远远超过了28s和18s,说明降解狠严重,至于内参,它的片段太小,无法说明整个RNA和反转录的质量,最好能上传一下你的cDNA图片吧,这样应该可以说明问题
我用的是一步法RT-PCR试剂盒,反转录和PCR是一起做的,没有单独反转录成cDNA,我想问一下,您说的cDNA是DNA和RNA的杂合链吗?还是双链DNA啊?
还想请教一个问题,我老师说虽然5s很亮,但是上面两条带还挺完整的,不影响我后面实验的,可是我觉得不是这样的啊?请求您的指导?还有关于内参的问题,为什么片段小不能说明问题呢?
一步法啊,那你是看不到cDNA的,你们老师说的我不好评说,也许你们老师是对的,呵呵,干嘛不自己去测一个od,一切都解决了。
cDNA的话是单链的,也可以说是反转录的第一链。
内参的话,因为一般片段都很小,很容易被覆盖,所以,鄙人认为不具参考价值,尤其你做长片段PCR的话。只能说明你操作没问题,不能说明你的RNA质量,
谢谢你的建议,我做的目的片段也很小,才300多点,我想还是重换引物试试吧!关于测OD,我们实验室没有条件,没有那种能加很少样的比色皿,所以我一般就只能跑胶看rna质量了
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我的理解,cDNA当然是单链DNA,因为就算在反转录过程中存有杂合链,也很快在RNA酶作用下被分解。转录成CDNA的目的就是为了易于保存嘛,