【求助/交流】同工酶试验中的一些问题

作者 小凡198807: 来源: 小木虫 350 7 举报帖子

下面是我查文献查到的总蛋白提取,淀粉酶同工酶和酯酶的提取方法：

总蛋白分析　茶薪菇成菇、幼菇、原基、菌丝, 雪莲菇成菇、菌丝, 各取少量, 加生理盐水, 超声波细胞粉碎机处理, 4 ℃下7 000 rpm 离心10 min , 分离上清液。取一定体积样品液(内含50μL 总蛋白) ,加入2 倍样品溶解液(2 %SDS、2 %巯基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚蓝、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 缓冲液) 于100 ℃水浴中保温3 min。聚丙烯酰胺垂直板电泳, 浓缩胶浓度为3 % , 分离胶浓度为7.5 % , 电极缓冲液为pH 8.3 的Tris - 甘氨酸电极缓冲液。在浓缩胶时, 电流稳流为12 mA , 进入分离胶后, 调至稳流18 mA。电泳结束后用45.4 %甲醇- 9.2 %冰乙酸混合液固定1 h , 用0.05 % (WPV) 考马斯亮蓝R - 250 冰乙酸甲醇水染色液染色过夜, 用5 %甲醇- 7.5 %冰乙酸混合液洗脱2～3 次。

淀粉酶同工酶分析　样品制备与上面大致相同, 只是以双蒸水代替其中的SDS。
聚丙烯酰胺垂直板电泳, 浓缩胶浓度为3 % , 分离胶浓度为7 % , 电极缓冲液为pH 8.3 的Tris - 甘氨酸电极缓冲液, 在4 ℃下, 稳定电压20 vPcm 时电泳。电泳结束, 将胶板小心置于200 mL 0.15 molPL 的醋酸缓冲液(pH 5.0) 中, 在37 ℃保温1.5 h。倒去保温液, 用0.15 molPL 醋酸缓冲液(pH 5.0) 冲洗胶板上多余的淀粉, 然后用稀释20 倍的显色碘液染色, 胶板逐渐变成蓝色, 在蓝色背景上出现各种透明条带,即淀粉酶带。

酯酶同工酶的研究
样品制备:称取一定量的不同发育期的菌体,按1∶2 ( g/mL) 加入冰冻0. 1 mol/ L 磷酸缓冲液(pH 7. 4) ,加少许石英砂于研钵中,研磨至糊状,4 ℃中13 000 r/min 离心10 s ,取上清液,按1∶1 滴加0. 05 %溴酚蓝- 25 %蔗糖液,搅匀备用。

电泳:采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法。分离胶浓度8. 7 % ,交联度2. 5 % ,浓缩胶浓度1. 9 % ,交联度5 %。每孔加样量30 μL ,电极缓冲液为Tris -Gly 系统(pH 8. 3) ,4 ℃下电泳,起始稳压200 V ,待溴酚蓝进入分离胶后,电压调至360 V ,电泳3 h 结束。

染色:EST 同工酶染色参照Shaw[6 ]方法进行。

固定、保存:待染色的酶带清晰后,蒸馏水漂洗,7.5 %醋酸- 30 %乙醇- 15 %甘油固定,保存,制成干片。

最后，问题就是第一个总蛋白提取里面2 倍样品溶解液(2 %SDS、2 %巯基乙醇、20 %甘油、0.04 %溴酚蓝、0.02 mol/L pH 8.0 Tris - HC1 缓冲液) 这个溶解液的配方是什么，比例多少？有相关的茶树菇总DNA提取或者同工酶试验的整体方案也行。
另外酯酶实验里面的染色方法有人知道怎么染色吗？该文献染色引用的是Starch Gel Electrophoresis of EnzymesmA Compilation of Recipes这篇文章。希望能告诉我染色方法。谢谢了。
食用菌的同工酶标记方法有的话也可以发上来啊，多谢多谢。

有哪位大哥看的懂的话告诉小弟一声，小弟不胜感激，金币是不会少的，能尽快解决的话，还是要靠各位大哥，拜谢拜谢·~·最近需要做这个实验~~ 返回小木虫查看更多

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