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【有奖活动】~细胞技术专题橱窗:晒晒你在生物材料研究中细胞学实验心得体会~

打造小木虫多媒体学术贴:

帖子导读:
【绿色部分】:细胞培养中经验技巧汇总。
【栗色部分】:细胞培养基本操作及疑难解答汇总。
【水鸭色部分】:细胞染色专题。
【紫色部分】:MTT细胞毒性实验及常见问题分析汇总。
【褐色部分】:细胞培养中污染的鉴别及防治方法汇总。
【蓝色部分】:生物材料的生物相容性细胞学实验一般方法介绍。
【橙色部分】:关于细胞固定相关资料

本文为原创,并且在不断补充添加中,谢绝转载,欢迎虫子们讨论,参与有金币奖励!
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生物材料研究中,细胞学评价一般不可避免。

成纤维细胞的微管丝

树突状细胞、细胞毒性T细胞(紫色)、NK细胞、调节性T细胞
在细胞培养或细胞实验(MTT、微核等等)中,除了一般应该注意的问题,相信每个虫虫做完实验会有一点点心得体会,不妨拿出来晒晒,一起分享讨论。实验中有什么问题也可以提出来一起交流解决。

免疫荧光染色技术

MTT法细胞活性实验
也不限于细胞培养或细胞技术,如果在其他生物相容性或生物材料制备实验中有什么好的经验或诀窍,也请拿出来分享,这样可以避免别的虫子走弯路,同时也能从别的虫子那里吸收经验,提高自己。
有价值的帖子,都会有金币奖励!

我先来抛砖引玉,有些是网上学来的,有些是书上看到的,有一些是别人的经验,也有自己的心得体会,说得不对的,请大家指正:
1、先从细胞复苏说起,养细胞不要循规蹈矩,书上说的是经典,但有时也需要灵活运用。一般要求37℃复苏细胞,我一般是使用39℃,融化了就马上把细胞拿走,细胞不会升温到37℃以上,这样复苏的时间更短,细胞受的伤害更小,有利于提高细胞存活率。
2、复苏好的细胞是否要离心去除保护剂,要看你的细胞是不是对保护剂敏感,我一般是不离心的,直接放到培养皿里,加入新鲜培养液,待细胞贴壁后换培养液就行了,其实对细胞的处理过程越简单,对细胞的损伤就越小。
3、关于培养液中是否要加双抗。开始养细胞时是加的,后来发现基本没有用。该污染的还是污染。而且双抗对细胞有毒性,如果细胞很脆弱,要尽量减少对它的伤害。
4、关于污染。防止污染要从良好的无菌操作做起。国内一般使用酒精灯燎烧,其实用酒精灯很危险,而且未必能起到烧死细菌的作用,如果烧的时间短,物品表面跟本烧不热,也烧不死细菌,烧时间长了容易把物品烧坏,而且容易烧到自己。在国外一般是不允许用酒精灯的。所谓的基本无菌操作就是主要那几条,如不要在打开的容器上方运动,不要过早打开容器,取物品要小心不要触及其他等等,还有一个最重要的:手上要干净,操作时可以经常用酒精喷一下,这点很关键。
5、关于污染后的救治。如果细胞不是很重要,发现污染就及时扔掉!否则容易污染到培养箱里其他细胞,甚至整个细胞房都会有污染源。平时要养成及时冻存的习惯。对于细胞培养液中经常出现的小黑点,数量少一般不会影响实验,如果数量很多,可以使用环丙沙星或诺氟沙星等,很便宜,加入一点点就可以了,连续使用一个礼拜细胞会很干净。
6、关于换液。如果细胞很脆弱,可以采用一次只换一半培养液的方法,如果细胞分裂很旺盛,每次可以全换掉。
7、关于消化传代。消化一定不要太过,不然对细胞影响很大。消化前最好使用PBS先洗一遍,可以缩短消化时间,细胞很容易就能消化掉了。
8、关于冻存。我喜欢用棉花包起来,然后直接放到-20℃,半小时后转-70℃,过夜转液氮罐。
下面主要是其他人的经验:
8、不要等一瓶细胞培养液完全用完,才启用第二瓶。最好第一瓶还剩一点时,就启用第二瓶,如果第二瓶培养液有问题(如被污染),不致于毁掉你所有的细胞。
9、不要指望让自己的所有细胞“步调一致”,即在准备用来做实验的几瓶细胞较一致的同时,使另几瓶细胞量有多有少,以确保细胞不致于同时长过了死掉,或同时因瓶内细胞太少没长起来。
10、有时候经验上的“多少瓶细胞长多满能接种多少块培养板”,比细胞计算板来得更可靠,毕竟用细胞计算板计算其实夹杂了太多主观因素。
11、有时遇上长假,又不想把细胞都冻起来(毕竟重新复苏的细胞状态还是要差点),可以把吹打过细胞的吸管的头在新培养瓶的培养液中沾一下,继续培养,一般能保持一个星期以上没有问题。各人可以根据自己的细胞摸索一下。
12、关于胰酶消化贴壁细胞,其活力主要在于浓度。所以我消化细胞时喜欢在倒掉旧培养液后将培养瓶立起来几十秒,吸去流下的培养液,吸极少量胰酶润一润,再吸走,再吸入一点点胰酶消化,轻轻摆动培养瓶,让胰酶浸润到所有的细胞。我试过多种细胞,一般这样消化个一两分钟,就可以吹打了。一般1ml胰酶能消化 2~3瓶细胞没问题,而且效果强于倒掉旧培养液后直接滴入1ml胰酶消化10分钟(毕竟倒掉旧培养液后瓶内不止残留1ml旧培养液,再入1ml胰酶,其浓度只有原来的一半)。
13、一种细胞养的时间长了,你会熟悉它的生长规律,比如按多少比例接种几天长至百分之多少,一瓶细胞长至多少时大概有多少个及某种细胞喜偏点儿酸还是偏点儿碱等等。而它会熟悉你的操作手法,比如消化后吹打的力度等等。总之,要想实验有好的结果,一定要人等细胞而不可细胞等人。状态再好的细胞,不经心的培养(长过没有及时传代或者消化不足吹打剧烈或消化过头等等)也得玩儿完;
14、谈到细胞消化,我个人喜欢在显微镜下看着(多看几个视野),待细胞间隙即将打开,细胞有变圆趋势时就迅速拿进超净台,吸出胰酶,用培养基终止消化,消化适度是吸管一吹,细胞呈“流沙状”下来,而不是整片细胞全部脱落。当然,这个过程,这个“流沙状”还得根据不同细胞来摸索具体时间。而且这个时间也是不定的,与细胞代次(老化程度)、上次消化程度等都有关;
15、在均匀铺板方面,6孔板以上呈十字交叉型晃动(动作轻柔、力度一致)。24孔板先加入一定体积培养基,再将高浓度细胞悬液打入孔内,不要太慢。96孔板用排枪将细胞悬液贴壁轻轻慢慢打入就挺匀了。
16、细胞培养的准备工作一定要做充分,最好准备至少两套高温高压消毒后的物品,做新的操作时先检点所有的东西是否准备齐全,比如配液时的滤器,分装所用的容器是不是足够等等。
17、所有实验物品,包括自己配的液体和购买的产品,都要标记清楚(比如名称,PH值、时间、还有自己的名字,如果是共用一个冰箱的话这一点很重要)。
18、冻存的物品尽量避免反复冻融,如果无法避免,也要尽早分装,一次用完。
19、细胞计数在开始培养时很有必要,但计数次数多了经验估计法也是很好的办法,必竟每次计数也不是那么精确,而细胞培养对计数也不是那么要求严格。
20 不同细胞应避免在同一环境同时操作,极易造成污染!
21 无论哪种传代细胞都应在其早代阶段建库,以免绝种!另外,随着细胞代次的升高,其特性是必要发生改变,后果就是影响实验进程!故,选择适宜代次细胞进行试验很重要。
22 一瓶细胞培养用液体尽量不要反复使用,这将增大污染机率。可用的办法即是将其分装成适当规格,一次用1瓶。
23 细胞培养板或瓶若要摞在一起的话,注意在箱内不要超过3层,否则,中间的会受热不均,严重影响细胞质量,可造成细胞生长不均匀,可能造成中间稀少,四周密集。
我们实验室细胞培养的条件比较差,因此细胞培养箱很少像大家说的那样经常用酒精擦拭和更换水盘,但是平时细胞却极少发生污染,我们的经验是在关键的操作上要特别小心,例如
1.滴管不要接触瓶口,吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
2.凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
3.初学者一般可以用培养瓶养细胞,个人认为瓶污染的机率要比皿小。
4.注意配制完全培养基时不要发生污染,在使用前一定要做无菌培养,因为一般应用污染后的培养基培养细胞后,很快就会发生特别严重的污染。
5.操作时一定按照实验室的要求,切忌粗心大意。

1. 如何选用特殊细胞系培养基?
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2. 何时须更换培养基?
视细胞生长密度而定, 或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基?
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基, 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基, 细胞大都无法立即适应, 造成细胞无法存活。
4.可否使用与原先培养条件不同之血清种类?
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清, 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 两者都是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼, 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horse serum) 则是指马血清。
6.培养细胞时应使用5 % 或10% CO2?或根本没有影响?
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统, 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时, 则应使用5 % CO2 培养细胞。
7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。
8. 细胞之接种密度为何?
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
9. 悬浮性细胞应如何继代处理?
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中, 稀释细胞浓度即可,若培养液太多时, 可将培养角瓶口端稍微抬高, 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶, 加入新鲜培养基稀释至适当浓度, 重复前述步骤即可。
10.冷冻管应如何解冻?
取出冷冻管后, 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化, 并注意水面不可超过冷冻管盖沿, 否则易发生污染情形。另冷冻管从液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管爆裂。
11. 细胞冷冻管解冻培养时, 是否应马上去除DMSO?
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外, 绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞), 在解冻之后, 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中, 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05%。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于–20 °C,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低, 并可减少污染之机会。
13.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?
欲回收动物细胞, 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟, 过高之转速, 将造成细胞死亡。
14. 细胞冷冻培养基之成份为何?
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能, 故不可将DMSO 直接加入细胞液中, 必须使用前先行配制完成。
15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何?
冷冻保存使用之DMSO 等级, 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即为无菌状况, 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中, 保存于4°C, 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质, 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO, 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
16.冷冻保存细胞之方法?
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4°C 30-60 分钟→-20°C 30 分钟→ -80 °C 16-18 小时(或隔夜) → 液氮罐长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C 至–80°C 以下, 再放入液氮槽vapor phase长期储存。-20°C 不可超过1小时, 以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
17. 细胞欲冷冻保存时, 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml vial, 融合瘤细胞则以5x106cells/ml为宜。
18.培养基中是否须添加抗生素?
除于特殊筛选系统中外, 一般正常培养状态下, 培养基中不应添加任何抗生素。
19.应如何避免细胞污染?
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
20.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?
原则上:直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
(1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
(2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
(3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
(4) 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2~3代。
(5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
(6)重复步骤(4)。
(7)在无抗生素的培养基中培养4~6代,确定污染是否以已被消除。
21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞, 是否能以肉眼观察出异状?
不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株, 无法以其外观分辨之。
22.支原体污染会对细胞培养有何影响?
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数, 代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
23. 侦测出细胞株有支原体污染时, 该如何处理?
直接灭菌后丢弃,以避免污染其它细胞株。
24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁?
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25.为何培养基保存于4°C 冰箱中, 颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性?
培养基保存于4 °C 冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时, 可以通入无菌过滤之CO2, 以调整pH 值。
26. 各种细胞培养用的dish,flask是否均相同?
不同厂牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 虽对大部分细胞没有太大之影响, 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
27. 购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形?
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少, 大都是因为离心过程操作上的失误, 造成细胞的物理性损伤, 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心, 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
28.购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳, 常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后, 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C 太久。
29. 收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因?
冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入和取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
30.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
31.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?
GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。
32.什么培养基中可以省去加酚红?
酚红在培养基中用作PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用,(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
33.如何用台盼兰计数活细胞?
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200~2000个/毫升,在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色细胞是死细胞。
34.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
35.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。
36.室温下配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?
缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同PH值。
50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同PH值
37.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?
我们推荐使用脱落细胞的方法,此技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴斯德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。
38.胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:
(1). 去除培养基。
(2). 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS。
(3). 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。
(4). 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
(5). 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)
(6). 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。
(7). 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
39.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少?
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
40.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗?
通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候计数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。
41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,在放置几天后颜色变紫?
这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口,在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟,来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。
42. 细胞培养基偶然被冻,可否继续使用?
如果细胞培养基偶然被冻,您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。
43. 无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗?
当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。
44. 培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
45.培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗?
大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。
46.为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。
47.保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃时,请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶,建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。
48. 如何解冻血清才不会使产品质量受损?
将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。
49. 血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞过滤膜。
50. 为什么要热灭活血清?
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞、平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
51. 有必要做热灭活吗?
实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量!
52. 为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?
有些胎牛血清产品没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。
53. 如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作:
(1)解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),非常容易产生沉淀物。
(2)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。
(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。
(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。
(5)若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。


细胞培养常用基本技术
一、 常用设备
1.准备室的设备: 双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品柜(放置消毒过的物品)、包装台。
2.配液室的设备:
扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液时搅拌溶液)。
3.培养室的设备:
液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱(-80℃)、空调、二氧化碳气瓶、书台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。
二、无菌操作
1.无菌室的灭菌:  
(1)定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。  
(2)CO2培养箱灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射
(3)实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
(4)实验后灭菌:用75%酒精(3‰新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
2.实验人员的无菌准备:
(1)肥皂洗手。
(2)穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
(3)用75%酒精棉球擦净双手。
三、无菌操作的演示  
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。
四、器械的清洗和消毒  
(一)玻璃器械洗消:  
1..新的玻璃器皿的洗消:  
(1)自来水刷洗,除去灰尘。
(2)烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
(3)刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘 干。
(4)泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
(5)烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。
(6)高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。
(7)高压消毒后烘干
(一)旧的玻璃器皿的洗消:  
1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。
2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液),12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)
5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。
(二)金属器械洗消:  
金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分钟)消毒,再烘干备用。
(三)橡胶和塑料:  
橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:  
1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。  
2.胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。  
3.胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。  
4.胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。  
5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:  
(四)其他消毒方法:
有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。  
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻(CoC12?6H2o)2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。  
注意事项:  
1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。  
2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。  
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:
A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。
五、细胞培养用液的配制与消毒  
(一)器材与试剂
干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤:  
1.水的制备:  
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
2.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):  
(1)溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4?H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。  
(2)移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。  
3. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:  
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
(1)称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。  
(2)用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4.青、链霉素溶液的配制于消毒  
(1)所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。  
(2)具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。  
(3)使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克?
5.RPMI1640的制备与消毒:  
(1)溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。  
(2)安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。  
(3)抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。  
(4)分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。  
(5)使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃时两周有效)。  
6.血清的灭火  
细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。  
7.HEPES溶液:  
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下:  
准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌,分装后4℃保存。  
注意:因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如:称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,过滤除菌后可完全(20ml)加入1L培养液中,或者每100ml培养液中加入2ml即可。  
8.谷氨酰胺:  
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,4℃下放置1周可分解50%,故应单独配制,置于-20℃冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。  
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1~4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶,-20℃保存,使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。  
9.肝素溶液的配制:  
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为0.56克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为?? ℃ 。使用时,向100ml培养液中加入1ml(精确可加入0.9ml)即可。  
10.Ⅰ型胶原酶:  
0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。  
11.明胶溶液:  
因为明胶难于过滤,所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克(配成100ml溶液)—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入50ml小瓶中,4℃保存。  
其他培养用液的配制:  
20ug/ml内皮生长因子  
注意事项:  
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。  
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张,放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。  
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。
六、细胞传代培养(消化法)  
具体操作:  
(一) 传代前准备:  
1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。  
3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。  
4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。  
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。  
6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。
(二)胰蛋白酶消化  
1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。  
3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。  
(三)吹打分散细胞  
1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。  
2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。  
3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。  
4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
(四)分装稀释细胞  
1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。  
(五)继续培养:  
用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。  
(六)传代细胞培养注意事项  
1.严格的无菌操作  
2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。  
七、细胞的复苏  
细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
具体操作  
(一)实验前准备:  
1.将水浴锅预热至37℃  
2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。  
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。  
(二)取出冻存管:  
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。  
2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。
(三)迅速解冻:  
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内。
(四)平衡离心:
用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min。
(五)制备细胞悬液:  
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。
(六)细胞计数:  
细胞浓度以5×105/ml为宜。
(七)培养细胞  
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误:  
1.水浴锅未预热或者未预热到37℃。  
2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。
八、细胞计数  
具体操作:  
(一)准备工作:  
取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。  
(二)细胞悬液制备:  
细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
(三)细胞计数:  
1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。  
2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:
(细胞悬液的细胞数)/ml= ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104  
说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释。  
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
(四)细胞计数要点:  
1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
(五)初学者易犯的错误:  
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。  
2.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。  
3.滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。  
九、细胞的冻存  
1.先将冻存管放入4℃冰箱,约40min。  
2.接着置于-20℃冰箱,约30-60min。  
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。  
4.置于液氮罐中长期保存。  
5.同时做好冻存记录,在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。  
注意事项:  
1.使用DMSO前,不需要进行高压灭菌,它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构,以至于降低冷冻保护效果。在常温下,DMSO对人体有害,故在配制时最好戴上手套操作。  
2.不宜将冻存细胞放置在0℃~-60℃这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。  
3.注意定期检查液氮罐内液氮量,及时添加。




细胞染色专题之一:台盼蓝
台盼蓝(Trypan Blue,也称Direct blue 14):一种死细胞染色用色素
化学名:
3,3'-{bis(azo)}bis(5-amino-4-hydroxy-2,7-naphthalenedisulfonic acid), tetrasodium salt3,3’-{双(偶氮)}-双(5-氨基-4-羟基-2,7-萘二磺酸),四钠盐
分子式:C34H24N6Na4O14S4
分子量:960.81
CAS Number: 72-57-1
外观:黑褐色结晶粉末
摩尔吸光度:>69,000(在606nm附近)
染色原理:
细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA 结合,使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说,台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性,通常认为细胞膜丧失完整性,即可认为细胞已经死亡。这被称为染料排除测试(dye exclusion),Erythrosin B(红色)、negrosine、eosin Y、AO和EB也用于此目的。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞,并可使用细胞计数器进行计数。
溶于水,可以配制成10mg/ml的水溶液,水溶液呈深蓝色。
台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况,用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟,在显微镜下观察即可。
应用于细胞凋亡:
如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。尽管在凋亡的早期到中期检测是很困难的,此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
储存条件:常温保存
注意事项:
1. 台盼蓝对人体有毒
2. 台盼蓝染细胞时,时间不宜过长。否则,部分活细胞也会着色,会干扰计数。
3. 台盼蓝染色法对于悬浮细胞来说,还比较方便,对贴壁细胞来说,较为繁琐。因为要消化,有时,96孔板不一定能消化干净。而且,该法是测定细胞浓度的方法,与细胞悬液的体积有关,加入的胰蛋白酶或1640要计入终体积。可以说,该法相对准确,可能有一些人为因素的干扰。
细胞染色专题之二:美蓝
美蓝
英文名:Methylene blue,Swiss blue
中文名:亚甲基蓝、次甲基蓝、品蓝、美蓝、亚甲蓝、四甲基蓝、盐基湖蓝、碱性亚甲天蓝等。
分子式:C16H18ClN3S
分子量:319.85 g/mol
结构式:
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Methylene_blue.svg
CAS Number:61-73-4
EINECS Number: 200-515-2
熔点:100 °C
沸点:分解
密度:?
吸收峰:668nm和609nm。
染色原理:美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。
细胞染色专题之三:吖啶橙
吖啶橙:N,N,N',N'-tetramethylacridine-3,6-diamine
中文名:3,6-双(二甲基氨基)吖啶
英文名:Acridine Orange( AO),Euchrysine,3,6-Acridinediamine,Waxoline Orange A,Acridine Orange Base,Solvent Orange 15,Rhoduline Orange,Rhoduline Orange N,Acridine Orange NO,Rhoduline Orange NO,Basic Orange 14
分子式:C17H19N3
分子量:265.35 g/mol
CAS number:10127-02-3
外观:橙色、红棕色粉末
染色原理:
吖啶橙(AO)与双链DNA形成发绿色荧光的复合物。AO还可与单链DAN或RNA形成发红色荧光的复合物。一个AO分子嵌入双链DNA的三个碱基对并发出最大波长为526nm(激发502nm)的绿色荧光。一个AO分子与单链DNA或RNA的一个磷酸基相互作用形成聚集或堆叠的结构,此结构发出最大波长为650nm(激发460nm)的红色荧光。因此,AO用于被利用来检测双链DNA和单链DNA或 RNA。它使得用氩激光激发器或流式细胞仪同时测定DNA和RNA成为可能。
光谱数据:与DNA作用时和荧光素相似,激发最大波长502nm,发射最大525nm(绿光)。于RNA作用时,激发最大波长移动到460nm(蓝光),发射最大移动到650nm(红光)。
染色程序:
1. 用PBS或合适缓冲液制备10-50μM AO溶液。a)
2. 将1/10细胞培养基体积的AO溶液加入细胞培养基中。b)
3. 37℃下孵育细胞10-20分钟。
4. 用PBS或合适缓冲液洗涤细胞2次。
5. 用带有500nm激发和530nm发射滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 由于AO可能具有致癌性,因此操作过程中须格外小心。
b) 可以用1/10浓度的AO缓冲液代替培养基。
储存条件:避光, 冷藏保存
细胞染色专题之四:碘化丙啶
碘化丙啶
化学名:3,8-Diamino-5--6-phenylphenanthridinium diiodide,3,8-二氨基-5--6-苯基啡啶二碘
英文名: Propidium iodide, Propidium diiodide; PI
分子式:C27H34I2N4
分子量:668.39
外观:红棕色粉末
应用:DNA染色
染色原理:
碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物,它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用 来与Calcein-AM或者FDA等荧光化合物一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。
光谱性质:PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。
染色过程:
1. 用PBS或适当的缓冲液制备10~50μM的PI溶液。a)
2. 将1/10培养基体积的PI溶液加入到细胞培养基中。b)
3. 在37℃培养细胞10-20分钟。
4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5. 用535nm激发波长,615nm发射波长的滤光器的荧光显微镜观察细胞。
a) 由于PI可能具有致癌性,请小心操作。
b) 也可以用1/10浓度的PI缓冲液代替培养基。
保存条件:4℃避光保存
注意事项:对人体有刺激性,请注意适当防护
细胞染色专题之五:罗丹明123
罗丹明123:Rhodamine 123
分子式:C21H17ClN2O3
分子量:381
外观:橙红色、红棕色固体/粉末
溶解性:可溶于DMSO
CAS Number:62669-70-9
染色原理:
Rh 123是一种细胞通透性的、阳离子的荧光探针,容易被有活性的线粒体摄取,没有细胞毒性。Rh123透过细胞膜在活细胞的线粒体内聚集,发出黄绿色荧光,可用于对许多种细胞进行染色,包括植物细胞和细菌。由于细胞内ATP的量与Rh123的荧光强度之间有相关性,此化合物被应用于检测细胞内的ATP。 Rh123还用于癌症研究。
光谱性质:l ex\l em (MeOH) = 505nm\534nm. e (505 nm, MeOH) = 97,000.
染色步骤:
1. 将0.4mg Rh123溶解到1ml DMSO中制备成1mM Rh123-DMSO溶液。
2. 用载玻片准备细胞。细胞数目应为5×10e4 - 5×10e5个/ml。
3. 孵育该载玻片,用PBS或Hank’s液洗涤细胞。
4. 用培养基稀释1mM Rh123溶液以制备1-20μM Rh123缓冲液。
5. 将Rh123缓冲液a) 加入载玻片并在37℃下孵育30分钟至1小时。
6. 去除Rh123缓冲液并用培养基洗涤细胞。b)
7. 用带有荧光素滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 加入细胞前将Rh123缓冲液放在37℃下孵育。
b) 洗涤细胞后为了固定,加入10%福尔马林缓冲液并孵育15-20分钟,接着用PBS洗涤。
储存条件:避光冷藏保存
细胞染色专题之六:溴乙锭
溴乙锭:Ethidium bromide
化学名:溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基啡啶
英文名:2,7-Diamino-10-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide,2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridinium bromide,3,8-Diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromide,3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide,Homidium bromide,EB,EtBr
别名:胡溴胺;溴乙胺菲啶;溴乙菲啶
分子式:C21H20BrN3
分子量:394.31 g/mol
结构式:
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Ethidium_bromide.svg
CAS number:1239-45-8
熔点:260 - 262 °C(from wiki)
性质:
从酒精中结晶的是具苦味的深红晶体,熔点238~240℃;20℃时溶于20份水和750份氯仿。
染色原理:
EB不能穿过活细胞的细胞膜,然而可以通过死细胞破损的细胞膜而对细胞核DNA染色。EB含有一个可以嵌入的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,由于EB-DNA复合物的荧光产率远大于未结合染料的荧光产率,所以当电泳凝胶中含有游离EB时,也可检测出少量DNA。它是一种高灵敏的荧光试剂,也是一种重要的荧光染料,常用于检测DNA和RNA。EB与 DNA结合后 抑制DNA的复制和转录。
光谱性质:
EB-DNA复合物的激发波长和发射波长分别为518nm和605nm。
染色过程:
1. 用PBS或合适的缓冲液制备10-50μM EB溶液。a)
2. 将1/10培养基体积的EB溶液加入细胞培养基中。b)
3. 37℃下孵育细胞10-20分钟。
4. 用PBS或合适的缓冲液洗涤细胞两次。
5. 用带有515nm激发波长和600nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。
a) 由于EB可能有致癌性,操作时须十分小心。
b) 可以用1/10浓度的EB缓冲液代替培养基。
储存条件:避光, 冷冻保存
细胞染色专题之七:曙红Y
曙红: Eosin Y
中文名:水溶伊红;四溴荧光黄;朝红;四溴荧光素钠;曙红钠盐;曙红,水溶性;黄光曙红
英文名: Eosine Yellowish,Bromoeosine,Tetrabromofluorescein
C.I. name: Acid red 87
分子式: C20H6O5Br4Na2
分子量: 691.9
性质:以AgNO3滴定Br-,I-,SCN-等时用作吸附指示剂。
CAS Number: 17372-87-1
MDL number:MFCD00005040
Colour Index Number:45380
光谱性质:最大吸收524.8 nm;最大激发490 nm
染色原理:
Eosin Y为酸性染料,将胞质染成粉红色(嗜酸性),是组织和细胞化学常用染色试剂之一,常与苏木精(hematoxylin,为碱性染料,将核染成紫蓝色(嗜碱性))联合使用(HE染色法)。
在免疫组织化学实验中,常作为衬染试剂以便于组织和细胞结构的观察。
存储条件:室温避光保存
细胞染色专题之八:苏木精
苏木精 Hematoxylin
中文名:苏木色精,苏木色素,苏木精,苏木素,洋苏木素
英文名:Hematoxylin,7,11b-Dihydrobenzindenopyran-3,4,6a,9,10(6H)-pentol,Natural Black
分子式: C16H14O6
分子量: 302.28
性质:
无色棱形晶体,遇光变红; 熔点100-120°C;难溶于冷水和乙醚,易溶于热水和热乙醇,溶于碱、氨和硼砂的溶液。含有3分子结晶水,在100~120℃溶于本身的结晶水中。在水溶液中,特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。
C.I. name: Natural black
C.I. number: 75290
CAS number: 517-28-2
EINECS number: 208-237-3
Beilstein Registry Number:91400
EG/EC Number:2082373
MDL number:MFCD00078111
染色原理:
苏木精是染细胞核的优良材料,他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜 色因处理的情况而异,用酸性溶液(如盐酸—酒精)分化后呈红色,水洗后仍恢复青蓝色,用碱性溶液(如氨水)分化后呈蓝色,水洗后呈蓝黑色。
用途:
一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花,用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铬盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析,并用作pH值指示剂,变色范围5.0~6.0,由黄色变紫色。
作为天然色素,多用于食品工业、日化工 业、皮革及织物染色等,病理实验中可作为细胞组织切片的染色剂.苏木水提物最早被发现有抗癌作用,随后的研究证明了其抗癌活性物质就是苏木精
细胞染色专题之九:孔雀绿
孔雀绿(Malachite Green)
中文名:孔雀绿,孔雀石绿,碱性绿,盐基品绿
英文名:Malachite green,aniline green, basic green 4, diamond green B, victoria green B,4--N,N-dimethyl-aniline)
分子式:C23H25ClN2 (chloride)
分子量:364.911 g/mol (chloride)
性质:
孔雀绿是有毒的三苯甲烷类化学物,既是染料,也是杀菌剂,可致癌。孔雀石绿一般有二种。第一种是天然的矿石,为水合碱式碳酸铜,呈翠绿或草绿色的块石,含71.9%CuO、19.9% CO2、比重3.9-4.03、能溶于酸类。主要用于铜的提炼和供作颜料,但并不用于水产养殖业。第二种是孔雀石绿染料 (Malachite Green Dyestuff),又有Anillne Green、China Green、Victorla Green等多个名称,是人工合成的有机化合物。它的生产是由1分子(mol)的苯甲醛Benzaldehyde和2分子的二甲苯胺Dimethyl aniline在浓盐酸混和下,加热缩合成隐色素碱Leuco base,在酸性下加过氧化铅使其氧化,并在(酸?碱?)性液中沉淀出色素碱,它是属于三苯基甲烷型的绿色染料Tryphenyl Methane Dyestuffs。
绿色闪光结晶,溶于水、酒精显蓝绿色;遇硫酸呈黄色,稀释后呈暗橙色;水溶液加氢氧化钠形成微带绿光的白色沉淀。PH值在0.13~2.0变色为黄~浅蓝~绿,PH值在11.5~13.2变色为蓝绿~无色。
CAS number:569-64-2
光谱性质:最大吸收616.5nm
染色原理:
孔雀石绿可用作生物染色剂,把细胞或细胞组织染成蓝绿色,方便在显微镜下研究。孔雀石绿也用作丝绸、皮革和纸张的染料。虽然称作孔雀石绿,但其实它不含有孔雀石的成份,只是两者颜色相似而已。
用于芽孢染色的步骤:
取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片,风干固定后,在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液,染色10分钟后, 用水冲洗,再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟,水洗,风干后镜检。芽孢 被染成绿色,营养体呈红色。
细胞染色专题之十:DAPI
DAPI
中文名:4,6-联脒-2-苯基吲哚(?)
英文名:4',6-diamidino-2-phenylindole,2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine,DAPI dihydrochloride
分子式:C16H15N5
分子量:277.324
CAS number:28718-90-3
光谱性质:与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm;与RNA结合时,最大发射移动到400 nm左右。
染色原理:
DAPI 为一种荧光染料,可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞,荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ,且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟,在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。
a、 正常的烟草细胞核:核形完整,染色质均匀。
b、 染色质固缩,向外周聚集,形成周边化。
c、 染色质进一步固缩,形成很多颗粒物质。
d、 细胞核破裂形成碎片,核解体。
染色步骤:
在细胞移植前,将DAPI 以一定的浓度加入培养基中,与细胞共同孵育过夜,用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI,在用酶消化后离心收集细胞,加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。
存储条件:-20℃避光保存(?4°C?)
注意事项:
1、DAPI强烈致癌,操作时要戴上手套。
2、贮存液用70%酒精配制,浓度100 μg/ml,可用黑纸包住,长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释,最终浓度100 ng/ml。
3、DAPI是非常优秀的DNA染料,固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。
细胞染色专题之十一:结晶紫
结晶紫(crystal violet)
中文名:(结)晶紫,氯化甲基玫瑰苯胺,结晶紫,龙胆紫,甲基青莲,碱性紫,甲紫,其溶液俗称“紫药水”
英文名:crystal violet,Methyl violet 2B,Methyl violet,methylrosaniline chloride,Gentian Violet,Basic Violet,
分子式:C24H28N3Cl
分子量:393.958 g/mol (6B)
结构式:
性质:
绿色具金属光泽晶体或深绿色结晶性粉末。易溶于醇,溶于氯仿,可溶于水,溶液呈紫色,不溶于醚。自水中结晶者有九分子结晶水。熔点137 °C (279 °F),215℃分解。浓酸中呈黄色,当pH值增大时其颜色变化是黄→绿→蓝→紫。与Sn4+、Tl3+、 Au3+和Sb3+的卤络阴离子及MoO 、ReO 等形成缔合物,能被苯、甲苯等有机溶剂萃取。在溴蒸气存在下,试剂与类脂质产生蓝色物质(黄色背景)。
用途:
用作酸碱指示剂,pH值0.15(黄)~0.32(绿),pH值1.0(绿)~1.5(蓝),pH值2.0(蓝)~3.0(紫)。用于非水滴定。还用于光度法测定硼、锑、铼、铊、钽、金、钨、锌、镉、汞等的离子缔合剂。并用作生物染色剂及用作薄层色谱法测定脂质的试剂。医用杀菌防腐药。
CAS number:8004-87-3
C.I. number:42535
染色原理:
常用于革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态,而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示
步骤:
  革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态,而且它还是细菌鉴定的重要方法,它可将全部细菌区分别革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。革兰氏染色法的步骤为:涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察。
  涂片 与单染色法相同。
  固定 与单染色法相同。
  结晶紫染色 染色1分钟,然后水洗并用吸水纸吸干。
  碘液媒染 染色1分钟,然后水洗并吸干。
  酒精脱色 用95%酒精脱色,直到酒精不出现紫色时即停止(大约半分钟),然后立即水洗,并吸干。
  番红复染 染色3分钟左右,然后水洗并吸干。
  镜检 在显微镜油镜头下观察,菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌;菌体显红色的为革兰氏阴性菌。
注意:
不应当与另外两种染色剂甲基蓝(methyl blue)以及亚甲基蓝(methylene blue)相混淆。
Hoechst 33258染色
固定液 50 ml
Hoechst 33258染色液 50 ml
抗荧光淬灭封片液 5 ml
说明书 1 份
保存条件:
4℃保存,Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。
注意事项:
Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。
Ø 需盖玻片与载玻片。
Ø 荧光物质均易发生淬灭,染色后的样品宜避光保存。
Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭,但仍宜尽量避光。
使用说明:
1. 贴壁细胞
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动数次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免气泡。使细胞接触封片液,切勿弄反。
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,详细图谱请参考下图。
2. 悬浮细胞
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
B. 离心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。洗涤期间手动晃动。
C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。
D. 稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左.
3. 组织切片
A. 对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,即可进行后续的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
E. 将切片置于载玻片上,滴一滴抗淬灭封片液,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,
Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱,左侧峰为吸收光谱,右侧峰为发射光谱。
DAPI染核
原理:
主要结合dsDNA;结合小沟的AT。DAPI也结合RNA,但其发射峰波长(500nm)要长于DAPI/dsDNA(460nm)。
DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时,下述方法可加以修改。
保存:
    10mg/单位,室温避光保存,小瓶内至少一年。制stock液,溶解100uM (DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3;DAPI dilactate分子量为457.5)DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺),4℃避光可保存6个月。
DAPI是诱变剂,水溶液可通过活性炭去除,要安全处理。
染色:
在所有染色完成后进行复染,不需要另外的固定和通透处理。
荧光显微镜复染方法:
1.        PBS平衡
2.        PBS稀释DAPI stock液至300nM,滴加300μL这种稀释液于细胞上。
3.        孵育5分钟。
4.        PBS中涮洗几次,涳干过量缓冲液,抗淬灭剂封片。
FISH复染:
样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液,有助于减少玻片上非特异背景。
1.        PBS中稀释至30nM,吸300μL滴于样品上,塑料玻片有助于平均分配染料。
2.        黑暗室温孵育30分钟。
3.        去掉盖玻片,PBS和dH2O中小心盥洗。
4.        去掉过量液体,绵纸在样品边缘小心吸取。
5.        盖上盖玻片,蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。
荧光显微镜观察。
Rhodamine 123 染色
中文名称:罗丹明 123
目    的:测细胞内线粒体的跨膜电位
EX/EM:  505/534
染液配制: 罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液,100ul/支分装,-20℃保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml。
染色步骤:
培养细胞
Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2~3次(缓冲液预热至室温或37℃)
Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小时
Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2~3次
加0.5ml Dulbecco’s PBS,上机测量
Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度)
原理:
AM酯的羧酸经修改不带电荷,易浸入细胞。一旦进入细胞,亲脂性集团被非特异酯酶切断,使其带电荷,从而溢出细胞大大减慢。一般,酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。AM酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解。
保存:
指示剂干燥避光4℃或-20℃可长期保存。
AM酯易水解,发货瓶中至少可放六个月。
用时AM应溶解于无水DMSO,并尽快使用(一周内),否则细胞运载能力下降。AM的DMSO储备液应避光、冷冻、干燥保存。盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备,冷冻-20℃避光保存,可放6个月。
应用:
用细胞浸透AM酯运载技术:
1.在生理缓冲媒介中将DMSO稀释至1-5μM。不可用含胺的缓冲液如Tris。
2.有机阴离子转运抑制剂苯甲酸(1-2.5mM)或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。苯甲酸和sulfinpyrazone是很碱性的,所以之后要重调pH值。
3.AM酯孵育细胞一般在20-37℃,15-60分钟,准确的浓度,时间和温度靠经验摸索。AM酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂,降低孵育温度可以减轻这一副作用。
4.检测荧光前,建议细胞最好在无指示剂媒介中(最好有阴离子转运抑制剂)洗,以去掉细胞表面的非特异吸附的染料。而后再孵育30分钟来进一步使细胞内AM酯完全脱掉。荧光素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止。
目    的:测细胞内游离钙离子浓度
EX/EM:探针在细胞外液无荧光,进入细胞后最大激发波长和发射波长为464/526
方法一:
染液配制:Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM),15ul/支分装,-20℃保存。染色时用15~50mM HEPES缓冲液将其稀释为1~20uM(如1.5ml 为10uM)。
染色步骤:
培养细胞
缓冲液漂洗2~3次
Fluo-3-AM (1~20uM) 37℃或室温孵育0.5~1小时
缓冲液漂洗2~3次
加0.5ml 缓冲液,上机测量

药物的细胞毒性
看来对于MTT法大家用得比较多,这里做个小结(以下紫色部分),欢迎大家补充!
四唑盐(MTT)比色法
操作步骤
接种细胞
(1)用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中。
(2)离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞,计数。
(3)将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。
(4)用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液,每孔加0.5×103-10×103 个细胞。
(5)将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。
(6)将培养板放至塑料饭盒中,于37℃湿润环境中温育1-3天,等细胞进入指数生长期时可加入药物。
添加药物
(7)用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释,共制备8个浓度。
(8)对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列各孔的培养基。
(9)在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照。
(10)在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D行可用于第一种药物,E-H行用于第二种药物。
(11)向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。
(12)将培养板放回塑料盒中,温育至确定时间。
生长期
(13)在药物作用期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入200μl新鲜的培养基。
(14)每日换液至2-3个PDTs。
存活细胞数的估算
(15)在生长期末,每孔中各加入200μl新鲜的培养基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
(16)用铝箔包裹培养板,于37℃湿润环境中温育4 h。
(17)弃去孔中的培养基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解残留的MTT-甲臜结晶。
(18)在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液(每孔25μl)。
(19)立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。
分析
以药物浓度为横坐标(X轴),吸光值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。
四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝,
?   四唑盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
无菌材料
生长液;胰蛋白酶(0.25%+EDTA,1mmol/L,溶于PBSA中);MTT: 3- (4,5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑,50mg/ml,滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液(0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH将PH调至10.5 );微滴定板(Linbro,ICN); 微吸头,最好放在高压灭菌的吸头盒中。
非灭菌材料的准备
塑料盒(无毒的聚苯乙烯,装培养板用);加样器;DMSO;ELISA读板仪。
体会(更新中)
1、尽管细胞计数很重要,考虑到使用血细胞计数板所测结果的不稳定性,建议不要过分依赖它。将细胞悬液大体计数并稀释后,用微量加样器分装入一96孔板的 几个孔内(旧板亦可),镜下观察细胞密度是否合适。
2、加样时最好使用多道加样器,尽可能减少加样误差。加样时请注意枪头有无气泡产生,避免液体吸入加样器,勤换枪头,频率自己掌握。
3、建议做药物细胞毒性之前,先用MTT法把握不同浓度细胞的生长曲线 ------ 很关键!
MTT原理、步骤、结果及分析
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下 tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。
MTT
步骤如下:
1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔
1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.
2:培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.
继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。
4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项:
(1)选择适当得细胞接种浓度。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3)设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。
MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,
IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!
举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入
计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率
例:
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值
较为全面的MTT大汇总
实验前应明确的问题
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则,可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值,输入excel表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。
4.培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持68h,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照孔加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
实验步骤
贴壁细胞:
1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2.5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况
3.5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5.终止培养,小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
悬浮细胞:
1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100?g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100?l 1640)。
2)置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3)每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)
4)离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
MTT的配制
MTT一般最好现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
PBS配方:
Nacl 8g
Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
调ph 7.4
定容1L
关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时,所测得的OD值的区间即细胞抑制率(或者增值率)的所呈现的线性关系最好,结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显,太密细胞可能都会凋亡,因为细胞长的太快营养会不够,最后导致死亡。且而细胞过密或者过少,增殖都会过快或者过慢,其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml,100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度,如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度,这样与对照的区别更明显,数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.
其它的声音:
1.首先细胞的接种密度一定不能过大,一般每孔1000个左右就够了,我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了,这样即使药物有作用,MTT方法也是表现不出的,最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验,增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手,20%的波动也是常见的,所以很可能是技术原因引起的,特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.
注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练,尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多,但是如果操作不熟,CV会在8%左右。另外,吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
首先说说我的一点经验:
1.吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的3到4倍,可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。。
2.吸管的吸液量最好在1ml左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管,总液量在5ml左右为益
3.吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100左右,就可以吹打均匀了(有人认为加细胞前吹打30-50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次,每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟,然后再以一定的速度吸取悬液。)
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快,否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆,一般都在孔的底部中央,而周边很少,这种不均匀的分散会产生接触抑制,影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中,向左3下,向右3下,在往返回复3下移动,目的是使得细胞能分散的均匀些。(铺板技术是MTT实验的关键,也是基础,一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞,最后细胞全死了,建议不要采用这种方法混匀细胞。
加入MTT
个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例,具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定,我认为MTT多加一些比少加好一些
MTT的量各家报道不同,一般是过量的,所以10ul即够了。如果不使用96孔板,培养基超过100ul,MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀,不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的
因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应,所以可以单独将药物和MTT加在一起,看会不会起反应。如果不起反应,就不用去除含药物的培液,直接加MTT即可。
如何清除上清
百家争鸣:
1.加DMSO前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。
2.我每次将MTT加入后,再孵育四个小时,然后用离心机离心1000G,5min。但是用枪小心地吸上清,还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧!
3.另外,可以直接将板翻转倒扣(垫几层滤纸)2-3次,比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍,或者倾斜一点帮助吸液,发现紫色结晶几乎没有肉眼可见的掉脱,但前提是你本身细胞贴壁要比较牢,半贴壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话,阴性对照组可能由于细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来,这样就不能直接倒掉上清。
4.做MTT时,这一步骤一定要小心,不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的细胞会被倒掉,从而影响OD值。悬浮细胞,不要翻板,离心后也不要翻板,这个方法害死人。
5.加完MTT反应3-4h后,从培养箱取出96孔板的动作要轻柔,避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸,有的细胞可以用排枪一起吸,有的则要耐心的一个个用枪头吸,枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底,且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平,这样也会使结晶脱落。
6.用医用的注射器加上针头吸取液体的,吸取时要把板子斜放,沿着壁吸取就好了!这次MTT我用1ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.
避免清除上清而改进的方法
由于一般可离心96孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做MTT时,用DMSO溶解得到结果也不好,不是得不到预期结果就是可重复性差。
解决方法1:用以下文献方法:周建军等,评价抗癌物质活性的改良MTT方法,中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457
具体方法:
配三联溶解液:10%SDS,5%异丁醇,0.012mol/LHCL,蒸馏水溶解。
三联溶解液:SDS10g,异丁醇5ml,10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液
操作:在培养板上加一定密度的细胞悬液,90ul/孔;如需给药,则再于同时(悬浮细胞)或4h后(贴壁细胞)加入不同浓度的药物10ul/孔,均设三复孔。另外,每块板上另没一个调零孔(只加培养液,不含细胞和药物)。培养2d后,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养4h,然后加入上述三联液100ul/孔,于37度放置过夜后,用酶标仪测各孔A570值。
优点:简化操作,提高了可靠性。
解决方法2:日本同仁有一种新试剂CCK-8试剂, CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST–8,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 染料(Formazan dye)。生成的甲 物的数量与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8试剂中已预先配入了进行细胞增殖和毒性分析所需的成分,无需再用缓冲液或培养基进行稀释;同时,CCK-8试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。因此,无需特别的技巧,就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好的实验结果。
优 点
1、简 便 只需一步即可得到结果
2、省 时 毋需预制,即开即用
3、安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂
4、快 速 省去了溶解除沉操作
5、灵敏度高 灵敏度高于MTT
6、重现性好 步骤少;无损失;结果准确
就是比较贵,如果经费充足,用这个是不错的。
进行细胞增殖分析的使用方法:
1、接种细胞悬液100μl于96孔板内,预先置于37℃,5% CO 2饱和湿度培养箱内培养。
2、在每个孔内加入10μl的CCK-8试剂。
3、把培养板放在培养箱内培养1-4小时*。
4、在450nm波长处测定吸光度,参比波长为600nm或600nm以上。
解决方法3:使用MTS
解决方法4:
加入DMSO
在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净,没有去掉上清直接加DMSO,一是沉淀会很难溶解.二培养液的颜色在检测时也能被测到,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸掉,因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下,尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净,空白孔也要留有等量的培养液,这样在检测时可以尽量去除培养液的影响,DMSO的量也可为100ul或150ul.
1.加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5-10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信.
2.加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶,溶解后尽快检测。如果实验孔不多,建议用此法,因其比振荡溶解效果好。
3.或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。
振荡是为了让甲臜溶解,这样才能更好的测量吸光度,振荡96孔板有专的振荡器,目的:扎破气泡.有气泡存在时,由于其对光的反射与折射作用(酶标仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓度),会导致结果偏移.
OD值的测定
至于测定波长的选择是因显色溶液而异的,对于DMSO,溶解后呈紫(红)色,490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT试剂盒用的不是DMSO,它的测定波长是570。(就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492,选用TMB显色液则用450);而对于SDS和酸化异丙醇,则选用570nm,并且建议以655nm作为参考波长。
DMSO溶后10分钟内测,越放颜色越深,而SDS做为溶解液测吸收光值,其值可在三天内保持不变.
细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大,细胞密度小吸光度也会偏小;另外跟细胞状态也有关系,细胞状态不好的话,吸光度值也会低的;细胞数目少,或者是培养的时间短,OD值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的OD值太高,很可能是细菌污染。
复孔直接的OD值差别一般应在0.1-0.15,差别太大考虑:1.接种细胞数不均匀,或是接种太多,应保证每孔一致,一般是每孔1000-10000个。可以细胞细胞计数后,加入细胞悬液,再补培养基到预定体积,并轻轻吹打几次,使细胞均匀分布,这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好,接种时应加含血清培养基。2.贴壁时间:18-24h,如果不够,未悬浮的细胞会被吸掉。
一般为了实验的准确,每个浓度可以设5-6个复孔,可以最后统计时,可以除去一个最高值和一个最低值,或者除去其中数据离谱的值,这些离谱数字的出现与细胞是否污染,细胞是否在培养期间死去,是否培养液蒸发过多,加MTT液是否准确,在37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否一定(1-4小时)等有密切的关系,当然测定OD值的仪器工作状态是否正常也非常重要!(一般开机预热20min)。
MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小。这和分析化学中的lambert-beer定律有关, 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中,经常出现标准曲线不呈直线的情况,特别是当吸光物质浓度较高时,明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量,将会引起较大的误差。在吸光光度分析中,仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定,实验条件偶然变动,读数不准确等。
在光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器,读数的波动对透射比为一定值;而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大,读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时,浓度测量误差都较大,即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间,或使吸光度A在0.2~0.8之间,才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时,测量的相对误差最小。
其它的声音:
1.最好用570nm波长的滤光片,因为MTT在这个波长的吸光度是峰值,换句话说灵敏度高。用其它波长的也有,一般是490nm,但我的经验灵敏度降低一半。
2.我们用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果复孔之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差. 我曾经看到园子的有些帖子报道说OD值大概在0.2-1.2范围内与活细胞数有较好的线性关系,但OD值在0.3-0.9范围内可能更佳,若你的OD值不在这个范围内则你实验的细胞数可能不太合适,应调整你的细胞数。
边缘效应
96孔板四周一圈的孔一般只做空白,不养细胞,否则这四行的数据会偏高或偏低,96孔板在培养箱中,由于湿度不够,而培养箱由于具有一定的温度,由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快,导致培养基中各种成分浓度变化增大,导致细胞状态不同。对于这种现象,要保证培养箱中的湿度,减少开关培养箱的次数和时间。解决方法:将孔板周围的一圈孔全部不用,影响非常大,而且最外一圈一定要加水、PBS或者培养液,只要能防止蒸发就可以.
关于如何计算IC50
(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大剂量
I:lg(最大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:最大阳性反应率
Pn:最小阳性反应率
举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入
计算公式:
Pm=0.95
Pn=0.06
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1
lgI=lg0.1/0.01=1
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
(2)Bliss法:自己查阅书籍
(3)IC50计算软件,见下面附件
(4)自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似!
(5)在线求IC50或EC50:http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm
结果统计学处理
所有数值以x±s表示,应用SPSS软件进行方差分析,p<0.05时为相差显著,p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线,专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组
excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下;你的数据应该用多个样本均数的T-test,方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。
孔板的重复利用:
培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好,因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质,在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次,即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。
强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以,但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长,会出现帖壁不好,细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底,如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.
重复利用时
做法1:
洗净后用2%NaoH浸泡4小时,再用1%稀盐酸浸泡4小时,冲洗15遍,蒸馏水冲洗3遍,烘干,UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)
做法2:
泡酸2-4小时,老师让我们别超过4小时,(普通的玻璃仪器是过夜)。捞出,冲洗干净,烘干后,UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起,钴60照射消毒.
做法3:
1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净,然后用洗衣粉水泡几个小时(小心最好让洗衣粉先化开)。2.用自来水冲净洗衣粉水,倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净(20次左右)每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍,双蒸水冲洗3遍,烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右,就可以用了,不可以高压。
做法4:
1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液,放入超声中超10-30分钟,晾干(或烘干)备用。
此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。
2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%),我一般加60ul,加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面,室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。
对于顽固贴附在壁上的细胞,此步骤最为有效。
3、甩掉胰酶,自来水下冲洗,晾干(或烘干)备用。
如果不烘干就泡酸,那么96孔板残留的水分将稀释酸液,长期以往泡酸的效果下降。
4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜,捞起后自来水下冲洗10遍;双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了,否则板子变黄,影响最后的OD值的测定。
5、做实验前,96孔板至少在紫外灯下照射30分钟,但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄,我的两块板放在超静台上忘了拿出来,一直照了两个星期,等我从超静台上取出板已经变成黄色。
注:
1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高,虽然有很多因素会导致数值偏高,但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部,再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹,这些痕迹就会使吸光度升高。
2、96孔板洗的次数多了,板底自然留下划痕,这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值),实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。






用Alexa488标记的抗人α-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(常规荧光显微镜照片,Shi Qinghua等)

用抗α-tubulin抗体染色显示微管(绿色); 细胞核: 红色, DAPI染色(激光共聚焦显微镜照片)


荧光原位杂交检测人染色体的完整性,示所有的染色体都具有着丝粒(绿色)、所有的染色体长和短臂末端都有端粒(红色)存在(Shi Qinghua, unpublished)


美丽的细胞荧光发光技术

LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管. 激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal

荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色)

细胞免疫荧光染色(Tuj-1)


正在分裂的细胞

染色体(蓝色)周围正在形成的微管
基于新材料的荧光发光技术是目前研究的热点




荧光素发光
  Epicocconone为一类水溶性的小分子中性荧光探针(410Da),所以Epicocconone很容易穿透胞膜结构进入细胞;另外,此探针对细胞生长率和其他功能没有任何不利影响;另外,此探针只有与蛋白结合后才发出红色荧光,所以无需洗涤未结合的染料。
   Epicocconone成为活细胞和固定细胞荧光成像的最理想选择。也特别适合与其他荧光染料联合使用,对细胞进行多色荧光标记。

LavaCell应用于活细胞(左)和固定细胞(右)成像

  LavaCell与SYTOX green(细胞核)联用于固定细胞多色荧光成像

美丽的荧光鱼

正在凋亡的细胞


上面的图像显示人类淋巴瘤(lymphoma)接受喜树碱这种抗癌药物治疗的情况。经过细胞凋亡的恶性肿瘤细胞呈黄色,并显示有特异性膜(membrane)疱(水疱)形成,说明经过细胞凋亡,恶性肿瘤细胞正走向死亡~

下面介绍的是细胞污染图片及细胞培养中抗菌与污染防治方面的总结(棕色部分),虫子们遇到相关问题可对比参照
细胞培养中污染的类型
细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物,而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质,包括生物和化学物质。
一、细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。
二、真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
三、支原体污染
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。
四、病毒污染
采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
五、非同种细胞污染
由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的,而现在句却认为是HeLa细胞。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。
非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。
(2) 污染来源及鉴别
一、污染来源
细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径:
1、不洁的动物组织标本
很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外),但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌,如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡,也会带菌,造成细胞污染。
2、空气
空气中含有大量的微生物,如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,净化工作台使用过久,滤板未定期更换或长久不更换,滤气受尘埃堵塞,工作时不带口罩或外界气流过强,污染空气进入操作区,也会导致污染。春夏季南方地区多雨,空气湿度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培养用物品、材料洗刷不净,培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。
4、操作
来自操作者的污染主要有以下几方面:
(1)  器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过,或者是否已经消毒灭菌处理过,或者虽经处理,时隔已久又末重新处理。
(2)  操作者未戴口罩、帽子,呼出气中排出细菌和支原体。
(3)  培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。
(4)  操作者不当心,动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品,如手上皮肤和瓶子外壁等。
(5)  操作者操作时大声说话,来回走动扬起灰尘等。
5、血清
市售血清灭菌不彻底,潜在病毒和支原体污染。
二、污染的鉴别
1、细菌、真菌污染的检测
(1)肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。
(2)镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
(3)接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染。
2、支原体污染的检测
(1)相差显微镜观察 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
(2)低涨处理地衣红染色观察 取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液,用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次,每次10分钟,取出盖片凉干。用培养液时,先吸取1mL,500~800r/min离心5分钟后去除上清,留0.2mL,将0.5%枸椽酸溶液加入其中,置10分钟,加入Carnoy液固定,离心弃上清固定液,余0.2mL沉淀物,制成2~3张涂片。然后用2%醋酸依地红(地衣红2g,冰醋酸60mL,加蒸馏水至100mL)染5分钟。纯酒精过三次,每次1分钟,封入Euparal或树胶中。若染色过深,可先用75%酒精脱色,再封片。镜下观察见支原体呈暗紫色小点,位于细胞外或细胞之间。
(3)荧光染色法观察 用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,然后用荧光显微镜观察。染色方法为:用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上,在细胞汇合前(即未长满前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗,1:3醋酸钾固定10分钟,再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟,置于蒸馏水漂洗1~2分钟,向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液,然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液,先离心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟,再用生理盐水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258染色10分钟,加入蒸馏水漂洗,离心去上清蒸馏水,加3~5滴pH5.5磷酸缓冲液,稍吹打使沉淀细胞重悬浮,用吸管吸出,滴于载物片上,盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。
(4)电镜检测 若条件许可,可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48~72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法(见第九章)。
(5)培养检测 将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基(Sigma或北京生物制品所生产的均可),培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀,然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中,再用琼脂培养基做分离培养,37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
(3)污染的清除和预防
一、污染的清除
培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;有细胞株留存的或可购置的,可在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。
1、使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL),污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外,还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理,每隔2~3日换液1次,传1~2代进行治疗。近年来有报道,4-氟,2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative, BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。这三种抗生素均用PBS配成250X浓缩液,-20℃保存备用,使用浓度Cip为10μg/mL,BM-1为10μg/mL,BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液,加入含BM-1的RPMI1640培养液,3天后再吸除培养液,加入含BM-2的RPMI1640培养液,培养4天,如此连续3个轮次,直至用33258荧光染色镜检证明已清除支原体后,再加正常培养液培养传代3-4次。
2、加温处理
将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验,摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后,再以41℃加温处理效果更佳。
3、使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦,不如用抗生素方便、经济。
4、其他方法
除了上述去除污染的方法外,还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等,但均较麻烦,且效果不确定。所以一旦支原体污染,除非有特别重要价值,一般均弃之重新培养。
二、污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手:
1、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
2、从操作者做起
(1)操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。
(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
(3)操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。
3、防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。
在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。
一、细菌与霉菌的污染
由于环境条件差和操作不当等原因,常可发生细菌和霉菌的污染。常见污染的细菌有革兰阴性菌如:大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等;革兰阳性菌有葡萄球菌等,真菌污染常可发生,尤其炎热、潮湿的季节十分常见,如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。霉菌和细菌生长迅速,能在短时间内抑制细胞生长,或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现大量颗粒,细胞变圆或崩溃,从瓶壁脱落。霉菌污染容易发现,大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面,肉眼可见,有的散在生长,镜下可见丝状菌丝,纵横交错于细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊,较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动,同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养,加以确定。抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防止所用培养液和血清的污染,日前应仔细检查有无混浊和菌丝存在,以防止在培养细胞时造成污染。
二、支原体污染的检测与去除
(一) 支原体的检测
1. PCR 法
原理: 该法是通过PCR 技术将支原体16srRNA 基因特异性扩增,来检测培养细胞中污染的支原体。PCR 引物选自16sr RNA 基因上的支原体特异片段,此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳,经溴乙啶(EB)染色后在紫外透射仪上进行检测。
16sr DNA 引物用水稀释至40umol/L。
(1)正向引物:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
裂解缓冲液:10mmol/L Tris-HCL(pH8.3), 50mmol/L KCL, 2.5mmol/L Mgcl2, 5g/LTween20 和5g/L TritonX-100。
蛋白酶K(proteinase K)贮存液:蛋白酶K 20 mg/ml 溶于50%甘油中,于-200C 贮存。
耐热DNA 聚合酶(如Taq 聚合酶)与相应的10X TAE 缓冲液(见附录A1)
琼脂糖(分子生物学级);溴乙啶(10mg/ml 溶于水中并避光保存)。
6X 加样染液(40%甘油、0.125%溴酚蓝和125mmol/L EDTA).
DNA 分子量标志(50ng/ml)、pBR322 DNA。
DNA 扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪(UV)、加样枪、PCR 管(0.5ml 或0.2ml)。
方法与步骤:
(1)样品制备
① 将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml 微离心管内,以最大转速离心15min。
② 弃去上清,将细胞再悬浮于100ul 裂解液中,然后加蛋白酶K,使终浓度为60ug/ml。
③ 置微波炉内60℃ 孵育1h,然后升至95℃ 10min,再将样品置室温中降温。
(2)PCR 扩增
① 在冰浴中对各样品制备PCR 重要混合物,对每个样品均加入:
10X PCR 缓冲液 5.0ml
25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul
40umol/L 16sr DNA 引物 每种引物1.0ul
40umol/L pBR322 DNA 引物 每种 2.0ul
pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul
DNA 聚合酶(5U/ml) 0.2ul
三蒸水 35.4ul
总量 45ul
② 用无菌去离子水稀释样品为1:10,1:100。
③ 于每个eppendorf 管中加45ul PCR 扩增混合物,每管中分别加入样品原液及1:10,1:100 稀释液各5ul,操作均在冰浴中进行。
④ 在每个eppendorf 管中轻轻加入50ul 无菌矿物油,覆盖在液面上。如DNA 扩增仪带有有制式热盖,此步骤可省略。
(3)将各管放入DNA 扩增仪的孔槽内,并执行以下循环指令:
① 95℃ 10min 一个循环
② 95℃ ,30S→580C 1min→72℃ 1min, 共30 个循环。
③ 最后72℃ 10min 延长循环。
(4) PCR 产物分析
① 制备含有EB 染料(0.1ug/ml)的1%琼脂糖凝胶(用TAE 缓冲液制备)
② 从PCR 扩增仪中取出样品管,取10ulPCR 扩增产物加到2ul 带有染液的加样液中,混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中,同时在对照孔中加10ul 标准DNA 分子量标志。
③ 凝胶置TAE 缓冲液中,电压80V,电泳 60-90min。
④ 凝胶电泳完毕,将凝胶置紫外透射仪下观察,有无被EB 染料着色的红色荧光DNA 条带,样品孔与标准DNA 孔进行比较并拍照。
质控与提示
1.阳性对照
(1)如果支原体DNA 可查到,则10ngDNA 即呈阳性结果。
(2)如得到已知支原体感染的细胞培养,细胞可同样品一样处理,作为阳性对照,处理的细胞置-20℃ 冻存,可重复使用。
2.阴性对照
(1)用45ul PCR 扩增液加5ul 无菌去离子水混匀,作为阴性对照。
(2)在含45ul PCR 扩增液的eppendorf 管中建立一个对照孔,以2ul 无菌去离子水替代pBR322 DNA(1pg/ml)。
(3)有时样品中可能含有聚合酶的抑制物,可阻抑PCR 扩增,这种情况很易被pBR322 扩增片段的缺失所识别。遇此情况是,应从同一培养物中另取少量细胞(105 个)重新制备一份样品,如果这样做仍无扩增片段出现,就将细胞在无抗生素的培养基中试生长2-3 周,然后再作支原体检测。因为抗生素能结合双链DNA,故有人怀疑抗生素具有抑制Taq 聚合酶的活性。
2. DNA 荧光染色法
原理: DNA 荧光染色法是以Hoechst 或4 / -6- 二氨基-2 苯基吲哚( 4 /-6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)试剂为荧光染料,使支原体DNA 着色,用荧光显微镜在感染的靶细胞的胞质中辩认出荧光,证明试验样品中存有支原体。
试剂与仪器
靶细胞 CKI-1(IFO5003,JCRB0008)或Vero 细胞(ATCC CCL82)
试验样品 约106 个细胞的培养上清液1ml
支原体 mycoplasma hyorhinis (ATCC 29052) M.orale(IFO 14477)
培养液 MEM+10%FBS(无抗生素) 无钙镁 PBS 固定液 ;甲醇:醋酸为3:1
荧光染液 ①浓缩染液(100mlPBS 中加Hoechst Dye 5mg 防腐剂 thimerosal 10mg 用磁力搅拌器助溶30min,每瓶分装1ml,严格避光保存于-20℃冰箱内)②使用液:将冻存的浓缩液取0.15ml 加入100mlPBS 中,(最终浓度为0.075μg/ml 的Hoechst Dye 0.15μg/ml 的thomerosal 防腐剂)用磁力搅拌器搅拌助溶30min,使色素完全溶解。(使用前调制)
荧光显微镜、各种吸管、60mm 玻璃平皿、10ml 离心管、4 个带有可活动玻片的培养皿、盖玻片(无荧光)
方法与步骤:
(1)检验材料的制备
①检体细胞的培养:被检细胞在不含有抗生素的培养中传代培养3 次以上(不低于3 次)在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液,经2-3 天培养。
②细胞回收:培养细胞上清液,以及用橡胶刮匙从培养皿上刮上的细胞,吸入离心管内,于4℃下,1200r/min,离心10min。吸弃上清,留下约含106 个及大约1ml 上清液。
③冻融:将离心细胞收集到冻存管内置-20℃冻结,30min 后置37℃孵箱内融解,如此反复操作2 次,于4℃1200r/min 离心10min,吸取上清液作为检体。
(2)标记靶细胞培养与检体的接种
①将液氮(-196℃)冻存的CKI-1 或Vero 细胞解冻(37℃1 分钟内迅速解冻)计数活细胞达2-3×103/ml,植入4 个带有可活动的切片在皿底的培养皿中,每培养皿1ml,置CO2孵箱内培养。
②孵育24h 后在显微镜下见细胞呈适当的密度(高倍镜下见160-240 个细胞/视野)时,弃去培养液,于每个带可活动切片平皿内换新鲜培养液0.9ml,在i 号皿内接种冻融检体0.1ml在ii 号皿内加0.1ml 培养液,作为阴性对照,iii 与iv 号皿内加入100cfu/0.1ml 的M.hyorhinis 和M.orale 支原体液,作为阳性对照。将4 个培养皿置CO2孵箱内培养6天。
(3)细胞固定、染色、封片观察
①吸弃培养液,用CMF-PBS 洗涤细胞加在可活动玻片上1ml 固定液,固定10min。
②吸弃固定液,风干后各加染色液ml 置室温染色30min。
③吸弃染色液,用蒸馏水洗3 次,取下可玻片的杠架和垫圈,取下可活动玻片。
④滴入封片液,其上复上盖玻片并赶除气泡和多余的封片液,四周用封片胶封闭。
⑤启动紫外系统,用荧光显微镜观察(放大约×400-600 适宜)
(4)结果判定
①在细胞质中观察有无荧光,试验样品与阳性、阴性对照对应观察。
②计数1000 个细胞,有5 个以上的细胞质中见荧光着色,可判定为阳性。
质控与提示
(1)标记的靶细胞除CKI-1 和vero 细胞外,3T6 细胞(ARCCCCL96)也可使用。本法成功的要点之一是用作靶细胞质控的管理应严格,必预先确认该细胞无支原体的污染才能冻存使用。
(2)要明确本检体的结果判定,必须使用不含抗生素的培养液。
(3)染色液:Hoechst 染液不稳定,故每次检测前须新鲜配制,使用DAPI 也可以,均应新鲜配制。
(4)试验检体:被试细胞回收时用橡胶刮匙刮下,不能用胰蛋白酶等水解酶类消化,制备好的检体细胞保存在-80℃冰箱中可存放数月。
(5)阳性对照:本试验采用支原体M.hyorhinis 和M.orale 为阳性对照,要十分注意避免有新的污染源。
(6)特异性与敏感性:本法不是支原体的特异性检出法,对DNA 进行染色观察,对其他微生物(细胞内寄生的霉菌、细菌等)的污染,也可看出同样的荧光染色,甚至检体会含有细胞的DNA 颗粒,都是引起结果判定混乱的原因。但细胞培养所污染的支原体,M.hyorhinis、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.fermentans 等约占支原体污染的97%,本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu,而一般污染细胞中的支原体浓度为103-108cfu/ml,故本法仍具有很好的实用性。
(二) 支原体的去除
由于支原体对细胞培养的交叉污染严重并在无意识之中发生,故对支原体检测为阳性的细胞株应丢弃;只对某些贵重的细胞株而言,才设法去除支原体。常用方法有药物法、免疫法、稀释法、加热法等。从感染的细胞系中去除支原体较简单的方法是用阻碍支原体DNA 或RNA 合成的抗支原体类抗生素处理细胞。普遍的抗生素在细胞培养液中对支原体是无效的。而用于去除支原体的药物均为喹诺酮类和/或四环素类抗生素的衍生物。
试剂与仪器
抗支原体药物:四环素与截短侧耳素的复合物(BM-cyclin);卡那霉素、二甲胺四环素与胼胝素协同使用,氟代喹诺酮类抗生素等,已有成品供应。
细胞培养基:25cm2 组织培养瓶
金属通风橱、CO2 孵箱、离心机等
方法与步骤
1.药物法 细胞的去除支原体处理
(1)支原体污染的细胞以105 个细胞/ml(25cm2 培养瓶中约10ml)接种于常规培养基并加有抗支原体药物,药物浓度为理论(想)值IC50。, 即采用5~10 倍于常用量的冲击法。
(2)培养48h 后,去除培养液,恢复原先处理,并在1 周内重复同样的处理。
(3)培养1 周后,将细胞接种于常规培养基内。
(4)常规培养2 周后,用前法所述检测细胞有无支原体污染,如果无支原体检出,则重复实验。2 至3 周后再次检测以确定该结果,经这样处理的细胞认为是无支原体污染的。
2.免疫法
要用抗支原体抗体或人及动物血清中的补体与污染细胞株于体外培养。支原体结合并裂解破坏支原体。或用动物接种法将污染支原体的肿瘤细胞接种于同种系动物皮下或腹腔,或接种于裸鼠腹腔,利用动物体内免疫系统杀伤支原体。
3.克隆法
克隆法即有限稀释法。将污染支原体的细胞进行有限稀释,接种于96 孔培养板,使之每孔只接种一个细胞,进行克隆培养,经前法检测,挑取无支原体污染的细胞克隆,这种方法对污染较轻的细胞株效果好。
4. 加热除去
根据支原体对热耐受性较差的特点,将受支原体污染的细胞置于41℃ 中作用5~10h,最长可达18h,以杀灭支原体,但41℃ 对培养细胞本身也有伤害,故在处理前应欲试验摸好条件。另外有人利用软琼脂技术,经50℃ 加热(4~6min)灭活污染细胞的支原体,再于37℃培养1~3 天,使琼脂中抗生素与支原体进一步作用,使热灭活的支原体彻底被清除。
质检与提示
三、内毒素污染的检测与去除
(一) 内毒素含量测定
原理: 本法应用鲎变形细胞溶解物(limulus amoebocyte lysate,LAL)LAL 来检测和/或定量革兰氏阴性细菌的内毒素,称鲎试验,鲎试验的机制是内毒素活化LAL 中前凝固酶而使凝固蛋白原变不凝固蛋白,使LAL 出现肉眼可见的凝胶从而可定量测知内毒素的含量。
试剂和材料
待测样品
用λ表示鲎试剂的敏感性单位(例如,λ=0.125EU/ml)(有商业成品)
对照标准内毒素(CSE)(有商业成品)
不含内毒素的水(即LAL 水)(有商业成品)
硼硅酸盐制,锥形终末反应试管(内径10mm,长75mm)(内毒素测定专用,有商业成品)
不含内毒素的氢氧化钠(0.1mol/L)
不含内毒素的盐酸(0.1 mol/L)
末被内毒素污染的硼硅酸玻璃制成的稀释用试管。
指示温度计
37±1℃恒温水浴箱。
方法与步骤:
测定内毒素水平需要进行两步(1)确定LAL 试剂的敏感度(2)检测待测样品中是否存在可能导致假阴性结果的干扰因素。
1.确证鲎试剂的敏感度
(1)根据CSE 的初浓度,用LAL 水将CSE 连续二倍比稀释,稀释后的浓度为2λ,1λ,0.5λ,0.25λ(例如,如果λ=0.125EU/ml,则浓度分别为0.25,0.125,0.0625 和0.0312EU/ml)(稀释管的体积是0.1ml)
(2)将各0.1mlCSE 稀释液转移到锥形末反应管中,然后向各管中加入0.1ml 的LAL 试剂。
(3)用封口膜封闭管口并轻轻混匀。
(4)37±1℃下孵育60 分钟,轻柔地倒置试管(180°),不要振荡,观察结果。当内容物形成坚实的凝胶,倒置试管后,凝胶仍然附着在管底,该结果为阳性。在每组稀释液中,具有最低稀释浓度的CSE 稀释液应呈阴性结果,如果均呈阳性结果,应提高稀释倍数,再进行试验。
(5)测定的终点是每组稀释液中最后出现阳性结果的稀释液的浓度。GEP=10m,m=Σe/f,其中e 为各组稀释液的终点的log 值的总和,f 为稀释液的组数。如果计算出的GEP 介于0.5λ与2λ之间,可确证鲎试剂的敏感度。
2.对干扰因素的检测
(1)用待测样品将CSE 稀释成上述终浓度。
(2)测定混合液的pH 值,并用不含内毒素的NaOH 或HCL 将该混合液的pH 值调至6.5—7.5。
(3)重复上述测定GEP 的发骤,计算GEP 值。如果GEP 值介于0.5λ和2λ之间,则样品中不包含干扰因素。否则,提高样品的稀释倍数,重复测定。
3.对样品的定量测定
(1)A:准备两试管,分别盛浓度为2λ和0.5λ的CSE。(0.1ml,用LAL 水二倍比稀释);B:用LAL 水将样品稀释,准备两组样品稀释液。(终体积为0.1m1,二倍比稀释);
C:用LAL 水作为阴性对照。(0.1m1);D:向样品中加入CSE 至CSE 浓度为2λ,以此作为指示样品中是否含有
(2)干扰因素的对照(0.1m1)
重复前述步骤,向各管中加入0.1m1 的LAL 试剂。
(3)如果实验有效,则必须:
①呈阴性结果(排除因试剂中含有内毒素而导致假阳性)
②呈阳性结果(排除干扰因素)
③确证了细胞溶解产物的敏感度。
(4)样品内毒素浓度:λ×B 的终点。
质控与提示:
(1)对于一般性的内毒素,可用CSE 代替较贵的参考标准内毒素(RSE),使用时将CSE 和BSE对比校正。
(2)使用前,剧烈振荡CSE,使其悬浮。
(3)轻柔振荡鲎试剂使其悬浮,避免起泡。
(4)实验应在空气不流动的房间里,无菌的操作台上进行,使用末被内毒素污染的材料。
(二) 内毒素的去除
原理:本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中,加热到250℃,持续30min,即可去除内毒素。
方法与步骤:
1.内毒素去除效率的评估
(1)制备浓度分别为1000 和1000EU/ml 的CSE 溶液。 按方法(一)检测这些溶液。
(2)向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1ml 的CSE 溶液。(每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE。)
(3)将玻璃器皿置入烤箱中,在60℃下,干烤持续30min,烘干,然后在烤箱中,250℃下,干烤30min。
(4)加入适量的LAL 水,剧烈振荡5min,以清洗玻璃器皿,然后测量清洗后的LAL 水中的内毒素的浓度。
(5)比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。当内毒素含量至少减少了3-log 时,该方法有效。必要时,重复操作,去除内毒素。用鲎试验法计算内毒素去除的百分比。
2 去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素含量下降3-log 的最佳方案。对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿,重复操作,直至内毒素含量下降3-log。(例如,1000→1EU 和10000→10EU)数个加热循环后,用前述的鲎试验法,测定内毒素含量。
对照
阴性对照 用只盛有LAL 水的玻璃器皿,在250℃下,干烤30min 并用LAL 法测量内毒素的含量。
阳性对照 干燥(60℃,30min)每种玻璃器皿中的内毒素溶液,不经过干烤(250℃,30min)
去内毒素的操作,然后测定其内毒素含量。
质控与提示
(1)确保烤箱散热均匀,为此,在操作过程中,可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上,当温度在250℃后,温度的波动不要超过±15℃。
(2)用含1000EU 的内毒素进行的检测,可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU 的内毒素进行的检测,可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
(3)如果结果不理想,可增加每一次操作的时间和操作次数。
(4)其他技术适用于培养基的去内毒素,例如,超滤,反向渗透,但比较昂贵。选取有效的滤过膜,确保去内毒素后,培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3-log。
细胞污染的思考
本人最近老遭到细胞的污染,前期的实验都在这一关被卡住,很是郁闷,需要追其原因,避免再次发生,由此小结了一下细胞培养过程中的一点经验教训,希望成为大家的前车之鉴。
细胞污染严重性:
污染是细胞培养技术中面临的主要问题。由每一种细胞有其独特的培养体系,因此污染造成后果也不尽相同。某些污染的发生(特别是支原体和少部分的真菌)往往难以察觉检测,而且污染源能长期共存于培养体系中,在实验前期容易被忽视。培养的细胞作为个生物体,会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应,造成培养细胞生物学特性的改变,而实验结果造成潜在的威胁,而且随着污染时间的长而增加。培养环境中的物理、化学及生物因素都可能入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养系中不断增殖、代谢,因此生物性的污染对细胞的害最大。随着污染微生物的不断增殖,交叉污染可能性也不断增加。此外,微生物代谢消耗大量需的养分,同时产生多种有毒的代谢产物,如酶、抗原及毒素等,进一步对细胞产生毒害作用。因此,认识细胞培养污染的途径及其危害性,建立细胞培规范的操作方法及规章制度,可以有效地防止污染保证实验体系的稳定性和可靠性。
细胞污染的类型
一、细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变而呈现黄色。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。一般细菌污染进程很快,大约污染一两天后肉眼就能显著观察到。
二、真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间(发生卵圆形物体污染的几率很大)。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
三、支原体污染
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物,最小直径0.2μm,一般过滤除菌无法去除它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。
培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生交叉污染。
四、病毒污染
采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞和会发生变异、转化,形成异倍体的细胞系。因此,潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
五、非同种细胞污染
由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的,而现在却认为是HeLa细胞。目前,世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染,致使许多实验宣告无效。
非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。
污染来源及鉴别
一、污染来源
细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径:
1、不洁的动物组织标本
很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外),但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌,如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡,也会带菌,造成细胞污染。
2、空气
空气中含有大量的微生物,如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下,很容易造成污染。另外,净化工作台使用过久,滤板未定期更换或长久不更换,滤气受尘埃堵塞,工作时不带口罩或外界气流过强,污染空气进入操作区,也会导致污染。春夏季南方地区多雨,空气湿度大,含菌量多,工作不注意也易造成污染。
3、清洗消毒
培养用物品、材料洗刷不净,培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。
4、操作
来自操作者的污染主要有以下几方面:
(1)        器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过,或者是否已经消毒灭菌处理过,或者虽经处理,时隔已久又末重新处理。
(2)        操作者未戴口罩、帽子,呼出气中排出细菌和支原体。
(3)        培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。
(4)        操作者不当心,动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品,如手上皮肤和瓶子外壁等。
(5)        细胞倾液时倒出培养瓶或者滴落在超净台上,未及时擦净或者灼烧。
(6)        灼烧的火不够旺。
(7)        移液管吸取液体时将空气中的气流吸入培养瓶中。
(8)        长时间的将离心管放在离心机中,可能由于口没有完全封闭而造成污染。
(9)        同一根吸管或者放置吸管的离心管长时间使用造成的一管污染多瓶细胞交叉污染。
(10)        操作者操作时大声说话,来回走动扬起灰尘等。
5、血清
市售血清灭菌不彻底,潜在病毒和支原体污染。
二、污染的鉴别
1、细菌、真菌污染的检测
(1)肉眼观察  细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。
(2)镜下观察  在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。
(3)接种观察  采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,也可发现是否有污染。
2、支原体污染的检测
(1)相差显微镜观察  将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。
(2)荧光染色法观察  用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合,可使支原体内的DNA着色,然后用荧光显微镜观察。染色方法为:用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上,在细胞汇合前(即未长满前)取出玻片,于碟皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗,1:3醋酸钾固定10分钟,再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟,置于蒸馏水漂洗1~2分钟,向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液,然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液,先离心去除上清液,再加入Hanks液漂洗,离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟,再用生理盐水漂洗后去上清液,再用Hoechst33258,DAPI或者PI等核染色试剂,染色10分钟,加入蒸馏水漂洗,离心去上清蒸馏水,加3~5滴pH5.5磷酸缓冲液,稍吹打使沉淀细胞重悬浮,用吸管吸出,滴于载物片上,盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点,散在于细胞周围或附于细胞表面。
(4)电镜检测 可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48~72小时,细胞接近汇合前,用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法。
(5)培养检测  将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基(Sigma或北京生物制品所生产的均可),培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀,然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中,再用琼脂培养基做分离培养,37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。
* 培养加荧光核染色是检测支原体污染的黄金搭档。
污染的预防
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到最小程度。在超净台中进行细胞培养时,特别注意在进行移液,倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生,飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生,应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用,如胰酶、培养液等。否则,一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。
一般预防可从以下几方面着手:
一.无菌操作基本技术
1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以5% 新洁尔灭擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以5% 新洁尔灭擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以5% 新洁尔灭擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目:
5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。
要特别注意的几点:
1、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用,并且需要尽快使用,特别注意容易染菌的液体如培养基,琼脂糖,血清等需要在低温保存,减少染菌的几率。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。。
2、从操作者做起
(1)操作者责任心要强,要细心稳重,操作技术要熟练。在制定好实验步骤后,头脑清醒的进无菌室进行实验。 备好一切所需要的试剂和培养瓶,防止在操作过程中来回跑动寻找,增加染菌的几率。在实验前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟,按规定穿隔离衣。进入后关好门,坐下来尽量少走动。工作开始要先用5%新洁尔灭擦手、擦带进的培养基瓶壁,和无菌操作台。严格遵守无菌操作规则。事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,以免造成大批污染。尽量减少在超净台中物品的放置,特别注意不能将物品放置在流通空气的虑孔上,以免降低整个超净台的工作效率。
(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼,注意火苗要旺盛,如果酒精灯中的酒精用尽要及时补充。要尽量使用侵斜试剂瓶45°的管架,减少垂直放置培养瓶造成染菌的机会。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
(3)操作时要常更换吸管,切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾,保持实验室清洁整齐,最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。
(4)操作过程中头脑清醒,动作敏捷果断,打开的培养瓶和瓶口应远离操作者手势范围,避免影响垂直的空气流将操作者身上的病菌带到培养细胞中。废液钢尽量避免使用敞口的容器,倾倒时要抬高一点,防止在倾倒废液时溅起的液体污染瓶口。
(5)防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分,最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作,避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置,或从别处引入,或自己建立,均应及早留种冻存,一旦发生污染可弃之复苏,重新培养。
细胞培养小技巧
一.实验用品
1. 实验用品种类︰
1.1. 细胞培养实验用品均为无菌,除了玻璃容器与pasteur pipet 外,其它均为塑料无菌制品。
1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附,培养容器种类有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依实验需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml,均有2 种不同材质,其中polypropylene (PP) 为不透明材质,polystyrene (PS) 为透明材质,可依实验需要而选择适合材质之离心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml
2. 清洗︰
2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1-0.05 N HCl 浸泡数小时,洗净后才开始使用。
2.2. 用过之玻璃血清瓶,以高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌︰
3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟,置于oven 中烘干。
3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170℃, 4 小时。
3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。
二.培养基
1. 液体培养基贮存于4℃ 冰箱,避免光照,实验进行前放在37℃ 水槽中温热。 0 S'、
2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月,期间glutamine 可能会分解,若细胞生长不佳可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例):
3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清,因此粉末培养基之配制体积为900 ml,pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加,若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2 气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基的pH 易发生改变。
3.2. 材料: 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水,水品质非常重要),粉末培养基,NaHCO3电磁搅拌器,无菌血清瓶,0.1 或0.2 mm无菌过滤膜,pH 计,真空泵,CO2 气体。
3.3. 步骤:
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中,搅拌使其溶解,然后通入CO2 气体至饱和,约3-5 分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否则不需用酸碱再调整之。若为太碱,可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,pH 会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

三.抗生素
1. 细胞库的细胞培养基不加抗生素
1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株,培养基中不加抗生素。
1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。
2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask 时,则须添加抗生素(青霉素100 units/ml + 链霉素100 ug/ml)。
3. 若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加庆大霉素,因庆大霉素会抑制支原体生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: 青霉素 250 units/ml, 链霉素 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, 杆菌肽 2.5 units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。
四.血清
1. 血清必须贮存于–20 ~ -70℃,若存放于4℃,请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶,可将40~45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %, 必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2. 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。 ! `% V5
3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般以50 ml 无菌离心管可分装40~45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4.热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须,一般不建议作此热处理,因为会造成沈淀物之显著增多,且会影响血清之品质。补体受到破坏。
5. 勿将血清置于37℃太久,若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。 生物6.2. 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“,但在37℃环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。
五.细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时,即须分至新的培养瓶中,一般稀释比例为1:3 至1:6,依细胞种类而异。
2. 材料:
2.1. 胰酶溶液(0.05% 胰酶): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃ 水槽回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 生物论坛,生3. 步骤:
3.1. 附着型细胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入胰酶溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 ℃作用数分钟,于倒立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉或者倾倒胰酶溶液。(若没有完全去除,则在胰酶作用后,加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用)
3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5-10分钟。
3.2.2. 吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。
3.3.杂交瘤细胞
有些杂交瘤需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分至新培养瓶中。
六.细胞冷冻保存 (一)
1. 注意事项:
1.1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好的指数生长期且高存活率,约为80-90%的汇合度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色。4℃避光保存,勿作多次解冻。甘油亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度:
1.4.1. 正常人成纤维细胞: 1-3×106 cells/ml
1.4.2. 杂交瘤细胞: 1-3 x 106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些杂交瘤细胞会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3.贴壁的肿瘤细胞系: 5-7 x 106 cells/ml,依细胞种类而异。腺癌解冻后须较高之浓度,而HeLa 只需1-3×106cells/ml。
1.4.4.其他悬浮细胞: 5-10× 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5×106cells/ml。 1.5. 冷冻保护剂浓度为5% 或10% DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个对照培养,以防止冷冻失败。+ n6
2.细胞冷冻保存的具体操作
2. 材料:
2.1. 生长良好之培养细胞
2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管
2.5. 0.4 % w/v 台盼蓝
2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)
3. 步骤:
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,混合均匀,置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约20ul) 计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,对应细胞适合的冻存密度混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 ml/管,并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5. 冷冻保存方法:在每一个冻存管上注明细胞系的名字,冻存者姓名和冻存时间,方便日后寻找。将一批细胞用橡皮筋捆绑住,用足够多的棉花将冻存管包裹,包括烧杯的底座和瓶顶,保护细胞逐级冷却,防止过快冷冻产生的冰晶破坏细胞状态,放入-80℃冷冻,然后放置于液氮中。
七.冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞的活化原则为快速解冻,避免冰晶重新结晶对细胞造成伤害,导致细胞死亡。
2. 细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3. 材料 37℃ 恒温水,新鲜培养基,无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶,液氮或干冰容
4. 步骤:
4.1 操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
4.4 取出冷冻管,立即放入37 °C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化以70 % ethanol 擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10~1:15)混合均匀,放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol),依细胞种类而异,一般而言大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内,离心1,000 rpm, 5 分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2 培养箱培养。
4.7 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
培养的细胞一旦被污染,应及时处理,以防造成其他细胞的污染。如果有价值的细胞被污染,当污染程度较轻,可及时排除污染物,使细胞恢复正常。常用的排除微生物污染的方法有以下几种。
(一)、抗生素排除法:采用5~10倍于常用量的冲击法,加入高浓度抗生素后作用24~48h,再换入常规培养物,有时可能奏效。抗生素常用量和效果如果下:
抗生素 细菌 真菌 支原体 常用量
青霉素 G+ 100u/ml
链霉素 G- 100ug/ml
庆大霉素 G+/G- 200ug/ml
四环素 G+/G- 10ug/ml
卡那霉素 G+/G- 50ug/ml
两性霉素B + 2ug/ml
制霉菌素 + 25ug/ml
(二)、加温除菌:根据支原体不耐热的特点,可将受支原体污染的细胞至于41摄氏度作用5~10h(最长可达18h),以杀灭支原体。但41摄氏度对细胞本身也有较大影响,故在处理前应先进行预实验,确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。
(三)、动物体内接种:受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内,利用动物的免疫功能消灭污染的微生物,而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长,待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养。
(四)、与巨噬细胞共培养:巨噬细胞在体外可存活7~10天,并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点,可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养,从而消除污染。
一种消除细胞培养中污染支原体的简易方法
蒋玖;
国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册, Foreign Medicine Section of Biological Products For Prophylaxis.diagnosis.and Therapy, 编辑部邮箱 1994年 06期  
作者用不同浓度的抗生素包括二甲胺四环素(MIN)、 (ROX)、卡那霉素和泰乐菌素 与严重污染型口腔支原体的 细胞培养物培育 ,然后检测对污染支原体的消除作用和对细胞的毒性作用 。

支原体污染防治
细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%,支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达,又不能通过可视法对其进行检测,而且它对细胞的生长率影响较小,不易引起注意。国内外研究表明,95%以上是以下四种支原体:口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii),为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群,但能够污染细胞的支原体种类是很多的,国外调查证明,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体.
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物.约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构.其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。
造成支原体高污染率的原因为:
1.支原体size 0.1~0.8 um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45 um)
2.支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4.细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染
5.研究或操作人员忽略污染问题
   支原体污染来源:
1.  已受污染的细胞
2.  操作人员的疏失
3.  已受污染的培养基、血清
4.  操作环境不良、实验器具不洁等
    支原体污染防治:控制环境污染;严格实验操作;细胞培养基和器材要保证无菌;在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生素,如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感;对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮;其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用,所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体,不影响细胞本身的代谢,并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞,不会重新感染支原体。
红霉素有效但红霉素不能完全根治支原体感染,停药后一段时间可以复发,热灭活可以试试,41度10个小时,可以杀死支原体,是一种比较简单的方法,对细胞损伤不大。用卡那霉素预防支原体污染有效。
检测方法:
1 相差显微镜检测;2 低张处理地衣红染色观察; 3 DNA荧光染色法;4 电镜检测;5 3-H胸腺嘧啶掺入法; 6 聚合酶链反映法; 7 免疫学方法; 8 支原体的培养。
3 、对于支原体污染的细胞,可以采取补救措施:
(1) 抗生素排除法:可以用5-10倍于常用量的冲击法,加入高浓度抗生素后作用24-48小时,再换入常规培养液,有时可能有效。推荐用量:庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ,卡那霉素50ug/ml 。对于支原体污染抗生素应用,预防性应用比污染后使用好。
(2) 加温除菌:根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响,故处理前,应先进行预试验,确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。

小鼠胃癌细胞的球菌感染图片(细菌污染)

念珠菌污染
      
白色念珠菌污染(倒置镜)
   
革兰氏染色阳性

革兰氏阴性菌(洋葱佰克霍德尔菌)


中间长梭形的是正在分裂的念珠菌

丝状菌污染图片(真菌污染)
   
真菌污染   

        
真菌污染

杆菌污染

霉菌

霉菌

酵母菌

支原体污染图(左图为污染,细胞间有丝状杂物,右图为对照)


细胞支原体污染的荧光检测方法
   
支原体污染电镜照片(煎蛋状)
   
支原体污染电镜照片(其它形状)

支原体污染电镜照片(其它形状)

支原体扫描电镜照片

冠状病毒电镜图
常规生物材料细胞毒性实验可包括:
1、直接接触法:细胞增殖度&细胞形态学 (L-929/HeLa细胞), 同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况
2、四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法(MTT法):简单、敏感
3、流式细胞光度术:同时可对细胞的核酸,蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定
基因毒性
1、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
2、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
3、Ames试验结果
4、体外微核法
*复合材料浸提液:美国药典方法描述使用多达四个提取液-盐水,盐水-酒精,聚乙二醇400 ,和植物油评价药剂。对于医疗器械的材料,盐水和植物油是用来保证提取的两种水溶性和脂溶性化学物质。

【关于细胞固定相关资料】:
单克隆抗体免疫细胞化学固定剂的选择
在做免疫细胞化学时,固定剂的选择是很重要的. 它关系到结果的正确性与否.
固定剂对细胞进行固定, 细胞内的成分和结构会发生改变. 这种改变有时会影响抗体与抗原的反应. 所以在选择免疫细胞化学固定剂时要考虑这个问题.
福尔马林对细胞的固定,会改变蛋白质的空间结构. 所以许多单克隆抗体无法用在福尔马林固定的细胞上. 但是有些单克隆抗体它们所反应的抗原表位在福尔马林固定后没有受到影响, 这些抗体仍然可以用在福尔马林固的组织/细胞上. 在使用时最好选择中性福尔马林或多聚甲醛.    检测细胞内的成分时, 福尔马林固定的细胞要对细胞膜打洞, 否则抗体难以进入细胞内而造成假阴性.
丙酮是一个很好的固定剂. 用它作固定时,对蛋白质的空间结构的改变很小. 所以大多数的单克隆抗体都能用在丙酮固定的组织/细胞上.
甲醇, 乙醇也可以用在免疫细胞花学上, 但它们对细胞表面的糖蛋白有影响. 所以不作为常规使用方法.
以上所述仅是对培养的细胞而言, 供大家参考.
丙酮如何配制?
回答: 直接用纯丙酮, 2到5分钟. 有人喜欢用冷丙酮 (40C 到 -200C), 也有人用室温的丙酮. 两者没有什么差异.
用Cytospin离心可以直接做免疫细胞化学么?
回答: 可以.
会不会阳性细胞难以选择呢?
回答: 我无法正确理解这个问题.
您那里做细胞蜡块有什么好的方法?
回答: 很少,很少做细胞蜡块. 细胞涂片能够解决问题,就不需要做细胞蜡块. 做细胞蜡块需要很多细胞, 有时送检的标本没有那么多的细胞供做细胞蜡块.
几种细胞固定方法
选择最佳固定液标准是:
(1)最好地保持细胞和组织的形态结构;
(2)最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的;
(3)不要用可能带有自发荧光的固定剂,如带有苦味酸的固定剂,还有甲醛升汞固定液,会使上皮细胞产生非特异性荧光;
(4)固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液
(1)4%中性甲醛固定液:最常用的固定液,能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作(Job)。中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的,其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处,保存时间不超过一个月。
甲醛(40%) 100ml
无水磷酸氢二钠 6.5g
磷酸二氢钠 4.0g
蒸馏水 900ml
(2)乙醇固定液:使用时以80%-95%的浓度为宜,具有硬化、固定、脱水等作用,对组织渗透力较弱,因此很少单独使用,但其保存组织中的核酸强于中性甲醛,故常用于有核酸操作的实验或检查,假如用于证实尿酸结晶和保存糖原,可用于100%乙醇固定组织。
(3)4%多聚甲醛固定液:主要用于培养细胞的固定。
混合固定液
(1)乙醇-甲醛(乙醇-福尔马林,AF)固定液:适用于皮下组织中肥大细胞的固定。该固定液有固定兼脱水作用,固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
甲醛(40%) 100ml
95%乙醇 900ml
(2)B5(醋酸钠-升汞-甲醛)固定液:多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。
无水醋酸钠 1.25g
升汞 6.0g
蒸馏水 90ml
使用前加入甲醛 10ml
(3)Bouin固定液:非凡适用于睾丸活检组织的固定。Bouin液对组织固定较均匀,收缩很少,不会使组织变硬变脆。需现配现用。
饱和苦味酸水溶液(约1.22%) 75ml
甲醛 25ml
冰醋酸 5ml
(4)Carnoy固定液:穿透能力强,可很好的固定细胞质和细胞核,非凡适用于固定外膜致密的组织,也适用于糖原及尼氏小体的固定。
无水乙醇 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
(5) Zenker固定液:经此液固定的标本,细胞核和细胞质染色颇为清楚,但成本较高且需非凡处理汞。该固定液要避免接触阳光,以免引起化学变化而失效。
升汞          5.0g
重铬酸钾        2.5g
硫酸钠        1.0g
蒸馏水(加至)    100ml
细胞固定
固定的目的是保持细胞形态尽量与生活时相似,防止细胞内的酶将蛋白质分解而自溶,沉淀或凝固细胞内物质,保持其与组织生活时相仿的成分,使细胞各部分易于着色。一般涂片如宫颈涂片、痰涂片,涂好后应立即固定。但如液体很稀薄,含蛋白质很少的尿液、胸腹水等,涂片后潮干固定,以免细胞漂落太多,影响制片质量。
(一)固定方法
1.浸入法 涂片直接浸入固定液内,因固定液充足,固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染,因此应该分瓶固定,固定液回收时应过滤。多数标本用此法固定,固定时间15-30分钟。
2.滴加法 将固定液直接滴加到涂片上盖满涂片膜,常用于需作瑞氏染色或迈格吉(MGG)染色的胸腹水细胞涂片。涂片一般是完全干燥后再固定。但因固定液量少,效果较差。
(二)常用固定液
1.95%酒精 最常用的细胞固定液,可加入l%量的冰醋酸(按95%酒精99份,冰醋酸1份的比例),以增强固定效果,并能对抗酒精固定的收缩作用。
2.乙醚酒精固定液 由95%酒精49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸lml组成,固定效果较好。但乙醚易燃、易挥发,价格贵,临床使用较少。
3.Carnoy液 无水酒精:氯仿:冰醋酸:6:3:l。此固定液穿透力强,固定效果好。但价格贵,配制麻烦,一般只在核酸、糖原和粘蛋白等特殊染色中应用。
4.甲醇 固定效果好,核结构清晰,常用于瑞氏、MGG染色或免疫组化染色的自然干燥涂片预固定。一般滴加数滴铺满涂膜即可。
5.丙酮 穿透力强,对酶类固定效果好,常用于酶的组织化学染色固定。
(三)注意事项
1.根据染色要求和固定液特点,选择合适的固定液。如巴氏HE染色,选95%酒精;MGG染色选甲醇固定液;瑞氏染色以空气干燥固定为宜。
2.防止交叉污染,保持固定液浓度。一般酒精固定液浓度低于90%以下,不再用作固定液。
3.液体标本应在涂片后,让其在奎气中放置片刻,待涂膜周边稍干而中央尚未干时浸入固定液即潮干固定,如等全部细胞干燥后再固定,染色后细胞肿胀、核染色质结构模糊不清,此称为人为退变,常严重影响诊断。
4.标本固定时间不宜短于15分钟,最好在48小时内染色。穿透力强的固定液勿过夜染色。如果固定时间已到,应力争及时染色
  固定液配方(细胞免疫组化,用的是4%多聚甲醛固定的):
我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的,然后再用0.1m PB稀释的。
0.1m PB配方(PH值7.4)1000ml
磷酸氢二钠 48.693g
磷酸二氢钠 5.023g
三蒸水 1000ml
12.5%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml
多聚甲醛 125g
三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌,温度控制在60℃以下,如仍不溶,加NaOH
(三蒸水先放800ml,10小时左右,再补加200ml)
4%多聚甲醛(PH值7.4)1000ml
12.5%多聚甲醛 320ml
0.1m PB 680ml
步骤:
1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中,按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片,5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。
2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。
3 冰丙酮固定 15 min。
4 空气干燥 5min。
5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
6 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。
7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。
8 3%H2O2孵育 15 min。
9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。
10 封闭血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液) 20min。
11 一抗孵育(PBS配,滴度1:200,湿盒)4OC 过夜
或37OC 60 min。
阴性对照最好用一抗来源血清,否则用PBS液
12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
13 二抗工作液孵育(湿盒) 37OC 30 min。
14 PBS清洗标本 3次 各 5 min。
15 C液(湿盒) 37OC 30 min。
16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。
17、DAB显色(避光,镜下观察至棕色 ) 约3~10min。
18、蒸馏水洗 2次 1 min。
19、苏木素复染 0.5~1min。
20、自来水洗 30min。
21、树胶封片。
1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础,要获得良好细胞爬片须注意以下:
(1) 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上,这样细胞爬片才较牢固,冲洗时不易脱片;
(2) 接种的细胞密度适中,以2*104/ml为宜,若细胞密度太高,5天后细胞连接成片冲洗时易脱片;
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4OC冰箱,冰丙酮固定时会使细胞收缩,可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿,(不可用吸管太用力吹,易脱片)
4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜
5、Triton X-100(屈立通)表面活性剂,脱去细胞膜中最主要的成分脂质,对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用,对于抗原表达在胞浆者时间要控制好,使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
欢迎虫子们补充讨论……
【本文谢绝转载】

http://blog.wuhunews.cn/uploadfiles/2008-12/142224541564.mp3

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用户评论

个人感觉润色或翻译还是很有必要的,不仅学习到很多方法,还可以很大提高发表的成功率。
同事推荐让我去专业君润色的,都是外国人润色的,可以提供润色证明,没有语言问题。润色4篇了,已经发表3篇
国内外期刊都推荐去专业君论文 润色,他们好像跟plos,bmc等都有合作。
拿去不谢!

这个不是mr_songhua 的帖子吗??

那么高的人气没有了:sweat::sweat::sweat::sweat::sweat::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry::cry:。

版主辛苦,正在学习中。。。

好,学习了。

虽然不懂!
佩服楼主的科研精神
顶!顶!顶!顶!顶!:D:D:D:D:D

科研精神令人汗颜!!!:D

有用没用,先支持一个!

谢谢,好好学习!

用荧光染色啊~~~~貌似莪在实验室里也做过~~但是没这个漂亮啊~~学习ing……

内容很丰富啊,还没有学习完, 先顶一个,楼主辛苦了

总结的真好啊,非常宝贵的资料啊,楼主太强了,赞一个~~·:arm::arm:

某些血清好像不符合要求,养细胞就污染,请大家使用时注意!!!!
如果发现没有任何理由的污染,要考虑到这一点

偶想了解细胞固定方面的知识

不错啊,草儿厉害!

我无话可说,只想对楼主表达一下我的景仰之情————我爱死你了。很详尽的资料,让我可以对细胞生物学领域窥豹一斑。

大力支持,这样的文章以后多来点!:D:D:D

细胞污染,跟细胞种类也有关系,有的细胞就是好养,有的就容易污染,例如原代细胞就容易污染,我有一个同学对滑石粉过敏做细胞实验从不戴手套(女的),细胞也没啥。
另外,楼主资料太好了,不会都对不住。顺便崇拜一下你,名字取得好,肯定是个有才的美女。。。。。。。呵呵,遐想中。。。。。。。。

谈到经验,有一个不好的经历,我有一次用别人的培养液换了几次液,我的细胞里竟然有那个同学的细胞相似的细胞,晕,但培养液没发现有问题,同学还用的好好的。所以培养液不要用别人的。呵呵。偷不到懒啊。

顶个,辛苦

太厉害了 看了一下 我也想做细胞方面的研究了 :rol:

很好很实用的东东!非常感谢!

怎么不能5星评价啊,支持我最喜欢的草妹妹!!!

十分感谢!!!!:):):):):arm::arm::arm:

楼主很强大~!特别是个人经验,启发很大,比书本上的死东西强很多。
最近准备做原代细胞的培养(鸡成纤维细胞),看了一些书籍,要么是很笼统,要么很抽象,一时摸不到头脑。不知道楼主有没有相关的经验,能传授一下,先谢了~!

Originally posted by jack83210 at 2009-7-22 20:51:
楼主很强大~!特别是个人经验,启发很大,比书本上的死东西强很多。
最近准备做原代细胞的培养(鸡成纤维细胞),看了一些书籍,要么是很笼统,要么很抽象,一时摸不到头脑。不知道楼主有没有相关的经验,能传授 ...
谢谢夸奖~:P
原代培养做过一次,经验还谈不上呢~只要注意不污染,还有胰酶要用质量好的胰酶,血清尽量用优质血清,其他问题应该不大的~

Originally posted by 薰衣草儿 at 2009-7-23 10:59:
谢谢夸奖~:P
原代培养做过一次,经验还谈不上呢~只要注意不污染,还有胰酶要用质量好的胰酶,血清尽量用优质血清,其他问题应该不大的~
谢谢,我会注意的。
这几天正在做一些准备工作,很快就要开始了。遇到问题会再来请教~!:)

这正是我最近苦苦寻觅的,谢谢版主啦!

资源好多,很好耶

好资源啊,花费不少心血,要顶上去,呵呵。怎么没有评分的啊?一定要五星推荐,呵呵

细胞培养的经验真是见仁见智,有人勤快,有人懒,可都有自己的方法把细胞养好,这也真的是自己的事情,别人不能代劳。

牛人。。。。。
膜拜之。。。。。。。。
拼命学习之。。。。。。。。

正要学细胞培养方面的实验,谢楼主~~~

非常好的东西,感谢版主

楼主太牛了 值得好好学 辛苦了

需要做细胞培养,这些很有用。谢谢

神贴 高度赞扬!

很好~收藏了哈~谢谢楼主

楼主真是有心了 总结了这么多 谢谢了

非常不错的帖子,希望在小木虫有更多这样有价值的文章

好全的,谢谢分享!希望以后能有机会交流!

:shuai::shuai::shuai:我最近每次做细胞都要染菌,已经接近崩溃的边缘了!老实说夏天真的不适合养细胞吗??

太感谢啦,非常全面,经典!向您致敬!

谢谢楼主总结

1楼: Originally posted by 薰衣草儿 at 2009-05-18 15:26:58:
打造小木虫多媒体学术贴:

帖子导读:
【绿色部分】:细胞培养中经验技巧汇总。
[c ...
斑竹,向你请教一个问题,细胞经台盼蓝染色后,波长在多大下观察是最好的啊,也可以说是台盼蓝的敏感波长是多少啊?

好好学习一下,谢谢楼主,辛苦了

顶下做个标记

谢谢楼主,很用心呀

好强大:hand:

细胞培养技术贴,顶!

非常好的帖子!支持!

太佩服了,:tiger05:

LZ看到我看到我,我最近要做水体细菌计数,总菌和活菌都要数,买了DAPI和PI,能不能指点下染色操作啊?中文文献不多,英文的又看不懂专业名词,求LZ指点!

初入贵宝地,求各位支个招,详情见上一楼~

真是太好的帖子了,内容太多了慢慢学习了辛苦楼主了~刚开始养细胞还有很长的路要走啊

很不错的东东,留着以后慢慢看

这个必须要顶,荧光染色的照片真好

版主辛苦,正在学习中。。。

碰到神贴,orz

内容很好。。

太感谢啦,非常全面,经典!向您致敬!

20楼: Originally posted by 长风6260 at 2009-07-02 13:24:04
细胞污染,跟细胞种类也有关系,有的细胞就是好养,有的就容易污染,例如原代细胞就容易污染,我有一个同学对滑石粉过敏做细胞实验从不戴手套(女的),细胞也没啥。
另外,楼主资料太好了,不会都对不住。顺便崇拜 ...
可以买无粉手套么。

太猛了 怒赞!

强者风范啊

不赞不行:hand::hand::hand:

刚接触生物这块,简直太难了
好帖,学习了

好帖,收益非浅啊

楼主辛苦了

赞 超级赞 我觉着就应该鼓励多发这样的帖子 太棒了 楼主

有很多图片看不了是怎么回事儿啊

楼主威武:D

必须要顶!

谢谢版主,很好的帖子,学习了:hand:

:hand::hand:看了开头,很实用的经验技巧。收藏下来慢慢看。

太感谢了,膜拜了~

刚开始做细胞实验课 需要学习很多 帖子帮助很大

太棒了!!!!

内容很丰富  学到很多东西

赞赞赞赞,大赞!

:hand:楼主太给力了

楼主辛苦啦!!!内容很丰富,很好很强大!!!收藏了。慢慢学习

请问胰酶是指的胰蛋白酶吗

:hand::hand:

有没有关于微生物诱变方面的知识啊,最近用5-氟尿嘧啶和吖啶橙做诱变剂,不知道缓冲溶液用什么啊??楼主可否提供一些相关知识啊?

谢谢楼主的分享,很有用