扩4000bp 死活出问题
求大神,扩4000左右条带,之前扩出过,隔了几个月再扩同样的引物重提的DNA,就不行了,为啥扩两次都是这种离孔很近的条带,5000的marker,dna浓度150ng/微升,引物10ng/微升,用的kod扩的,体系是推荐体系,三步法94度2min(98 10sec.Tm此处用55到57梯度都跑过30sec.68 2min推荐30sec/kb)34cy
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你最上面的应该是基因组DNA,而且条带亮度不止150ng, 我们实验室一般扩基因组片段,DNA加60ng。引物是10ng/ul? 不都是用的10uM么
重新提的模板,如果挑的单克隆,也有可能你扩增的片段丢失了
换TAKARA公司的LA taq酶试试,扩增长片段效果非常好。而且不需要摸索退货温度,直接98度变性,68度退火加延伸两步法PCR。至于你实验重复性不好我觉得可能是你的模板提取的质量不高,如果不想重新买酶的话试试把模板再好好提取一下吧。
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第一,DNA量要少加一些,这么亮扩出来是幸运,一般干不出来。100-150ng足以。第二,可以换一些比较牛逼的高保真酶,咨询卖试剂的,他们会给你搞到的,而且一般是试用装。
用东洋纺 的KOD-plus neo,我用过的几个酶里最好用的