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求问大神P出两个条带

求问大神,p出两个条带是什么原因呢,我要的是上面那一条一千多bp的,准备切胶,下面那条可以直接不管吗……
求问大神P出两个条带

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用户评论

引物特异性不好或者Tm值低了,就会有杂带出现。你胶回收直接切下需要的,回收。别的丢掉。

吓我,瞥一眼,以为是要求大神给你PS两天带呢!

你接下来要做什么,连接嘛?条带太弱了,我建议你换个程序重新P吧

引物特异性不好,只要能连接上,这个也不重要。要是有问题的话建议重新设计引物或者提高退火温度试试。

4楼: Originally posted by ladejueshi at 2017-06-16 13:12:53
你接下来要做什么,连接嘛?条带太弱了,我建议你换个程序重新P吧
换程序是指??

5楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2017-06-16 18:08:40
引物特异性不好,只要能连接上,这个也不重要。要是有问题的话建议重新设计引物或者提高退火温度试试。
就是觉得这对引物很奇怪……温度梯度从38度试到了60度,只有38度和40度亮了,40度亮的最好(就是有两个条带),同一个基因的另外一对引物温度也挺低的,46度,扩出来挺亮的,但是位置又不对……这应该怎么办呀,是这个基因它就这样了吗?

3楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2017-06-16 12:23:18
吓我,瞥一眼,以为是要求大神给你PS两天带呢!
这就很尴尬了

2楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-16 11:52:38
引物特异性不好或者Tm值低了,就会有杂带出现。你胶回收直接切下需要的,回收。别的丢掉。
可是我试了温度梯度,从38度试到了60度,只有40度亮了,这种情况怎么办呀

9楼: Originally posted by Erlineee at 2017-06-17 08:46:28
可是我试了温度梯度,从38度试到了60度,只有40度亮了,这种情况怎么办呀
...
引物没设好吧,引物设好后blast一下,特异性好了再去合成。

10楼: Originally posted by bbass533 at 2017-06-17 13:05:01
引物没设好吧,引物设好后blast一下,特异性好了再去合成。...
还想再追问一下……大神不要嫌我烦……blast结果我不太会看,E值的话如果为0是怎样,E值大一点好还是小一点好

6楼: Originally posted by Erlineee at 2017-06-17 08:40:38
换程序是指??
...
换个PCR反应条件,比如你原来是3步法,用2步法试试,或者改变退火温度等

1.引物特异性偏差
2.模版或引物浓度偏高
3.酶用的太多
4.镁浓度偏高
5.退火温度偏低
6. 循环次数偏高
你还可以试一下touchdown PCR。

引物特异性不高

6楼: Originally posted by Erlineee at 2017-06-17 08:40:38
换程序是指??
...
密不外传的程序,在这里不方便透露

可以考虑换个酶做吗,我上次也是这样,又换了个酶,改了程序就好了

换引物吧,感觉有可能是你的上下游引物的Tm值差距太大,特异性不好

11楼: Originally posted by Erlineee at 2017-06-17 17:46:56
还想再追问一下……大神不要嫌我烦……blast结果我不太会看,E值的话如果为0是怎样,E值大一点好还是小一点好
...
哎呀,E值代表什么意思我还真不了解,有木有虫友知道的来个解释。

换引物要么提高退火,太杂了,或者切胶回收做二轮,也可以切胶回收连T载体,凃板筛菌,提质粒,再扩

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