救命啊!荧光定量PCR 扩增问题
质粒扩增和样品扩增曲线不一样。
1,湖水总细菌DNA提取,Omega biotek的水体DNA提取试剂盒
2,引物为文献中的经典引物,退火温度在梯度PCR仪上找的较为适合的温度。
3,荧光定量PCR仪为ROTOR Gene-6000,试剂盒为QIAGEN。
4,质粒是用样品DNA的PCR产物,回收后重组后提取,按10倍稀释成标准品。
结果,每次做的试验结果,样品的扩增曲线总是很奇怪,不光滑。和质粒就很不一样。我已经排除了以下几个原因:
1. 扩增体系,QIAGEN 和Takara的试剂盒都试过,一样的 问题
2.仪器问题,用过ABI7500比较过,一样的 问题。
3. 引物,都是文献中比较常用的引物,noszF/1622-R等。
4.模板,借用了别人用mobio提取的土壤DNA,也有问题,是不是可以排除不是试剂盒的问题?
5.耗材,ABI和Axygen的用,也没有解决问题。
求救,博士二年级了,文章还在等数据,急死人了,不知道有没有碰到这样情况的,请教啊~
返回小木虫查看更多
今日热帖
额,,帮顶一下吧。。。
换一种菌的DNA为模板试一下,有可能是从土壤中提取基因组含有杂质影响qPCR的体系吧。排除样本质量的影响
把湖水提取出来的模板DNA稀释十倍,一百倍或者一千倍后试试,保证楼主能得到心仪的扩增曲线
扩增曲线不好应该是样本的问题,纯度和浓度要注意下
这个模板原因,也是我目前很想解决的问题,不知道用qiagen的DNA回收纯化试剂盒能不能解决~样本质量的影响,要怎么解决咯~?
另外,不知道怎么给金币,呵呵,没经验~
,
呵呵,谢谢~我觉得我的DNA浓度不算高啊,不过不管怎样,我先试试看。