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丝状真菌的基因敲除

作者 ldy-529: 来源: 小木虫 350 7 举报帖子

我最近要敲除掉曲霉里面的两个基因，大概的方案如下：
单独敲除1基因，单独敲除2基因，以及将两个基因都敲除，来研究他们的功能。单独敲除一个基因的载体我都获得了，是通过农杆菌介导转化的，可是不知道如何来进行基因的双敲除载体的构建，不知道真菌里面有没有双交换的概念。有没有做真菌基因敲除的高手啊，真是不慎感激啊！返回小木虫查看更多

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精华评论

syn1985

我也在进行这方面的研究，不过做的不是真菌而是放线菌，因为工作还未做到那一步所以经验肯定没有LZ足，有点个人的观点：不知道这两个基因是否在一个基因簇上？如果要同时敲除两个基因，可否试试同时转染两种质粒载体呢？
zff912

楼主很羡慕你都做到功能验证这步我是刚开始转化用的也是农杆菌介导转化的方法有个问题想请教你农杆菌放在-20会不会影响其活性我做的转化一直不稳定时而好时而坏的也不知道原因
gumingzhu

引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-05-03 17:18:20:
我也在进行这方面的研究，不过做的不是真菌而是放线菌，因为工作还未做到那一步所以经验肯定没有LZ足，有点个人的观点：不知道这两个基因是否在一个基因簇上？如果要同时敲除两个基因，可否试试同时转染两种质粒载 ...

你好，想问一下你敲除用的什么方法转化，原生质体，电转化，还是结合转移，最近也在做放线菌敲除，纠结中
syn1985

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Originally posted by gumingzhu at 2011-06-27 14:11:28:
你好，想问一下你敲除用的什么方法转化，原生质体，电转化，还是结合转移，最近也在做放线菌敲除，纠结中

我用的是接合转移选个质粒试一试就知道了何必纠结
gumingzhu

引用回帖:
Originally posted by syn1985 at 2011-06-27 18:31:00:
我用的是接合转移选个质粒试一试就知道了何必纠结

谢谢，我们接合转移和电转化都在做，只是还没好得到结果，只能慢慢摸索了
jinkui960

引用回帖:
Originally posted by ldy-529 at 2011-05-03 15:49:04:
我最近要敲除掉曲霉里面的两个基因，大概的方案如下：
单独敲除1基因，单独敲除2基因，以及将两个基因都敲除，来研究他们的功能。单独敲除一个基因的载体我都获得了，是通过农杆菌介导转化的，可 ...

尽管你构建了敲除一个基因的载体，但看来你不太明白敲除的原理，真菌基因敲除一般是基于同源重组技术的，也有基于随机插入突变的。基因敲除方法可以参考文献：“A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. Proc Natl Acad Sci USA 103: 10352–10357.”

建议你认真研究一下你自己构建载体的原理，如果你要进行双敲除的话，得选择另一个筛选标记，如hph和Bar等，载体构建的方法和你敲除基因1的方法是相同的，只是把筛选标记换成另一种！

祝好运
，