【求助/交流】基因敲除试验
我最近在做基因敲除试验，看了很多的文献，有一个问题一直让我很困惑，希望大家帮我解惑，谢谢！
我的方法是首先扩增要敲除的基因的全序列，并将其连接在骨架质粒pUC18的多克隆位点中，然后要将抗生素抗性基因插入到该基因中间，使其失活，从而构建用于基因敲除的自杀质粒。我不明白的是该抗生素抗性基因需要自己的启动子吗，还是它可以利用质粒本身的启动子进行转录翻译？
我看过很多文献，在这一点上都未做详细说明。但经过分析（查看抗生素抗性基因的长度），好像不需要自己的启动子。
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京公网安备 11010802022153号
确切的说，需要
一般都是在抗性基因的atg前面多留100多个碱基~
加抗性基因是后一步了，所以试试看，不行再留长一点。有抗生素筛选，表达了就行
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！
[ Last edited by 天使托 on 2011-1-23 at 10:33 ]
你的意思就是抗生素抗性基因还是要有自己的启动子，是吧？
我还有个问题，质粒上带的抗生素抗性基因的启动子一定紧靠它的前面吗？有的质粒带有双抗，那它的启动子是一个还是两个？ 谢谢！
他们是各自的启动子，如果两个抗性基因是反向的，那怎么用同一个启动子吗？
其实你大可不必担心启动子的问题，如果这个质粒是没有问题的，那么它的抗性基因肯定也会正常表达，还有一种情况，就是一个质粒上有两个抗性基因A和B，在一种菌里是A抗性，但是到了B菌里就是另外一种抗性了
，
我做的是基因敲除试验，我只是担心如果我只扩增抗性基因的ORF，那它没有启动子，在新的质粒中能否表达。
这个不是你担心的问题，一般你所用的质粒上面会有相应的抗性基因，这个质粒是人家已经构建好的了，所以放心使用，你要担心的是如何有效的验证你的基因是不是被敲除了！
不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是否要带有自身的启动子，如果不带的话，在该质粒中能否正常表达。