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【求助/交流】PCR反应体系请教！

作者 hnndpt: 来源: 小木虫 650 13 举报帖子

最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。

                  水： 12.2微升
                  10*buffer： 2微升
                  DNTP:2微升
                  引物F（5PM）: 0.8微升
                  引物R（5PM）: 0.8微升
                     Taq:  0.2微升
                     CDNA模板：2微升
早上来老板说酶加少了，应该加2微升，引物应该提高到4微升。排队等PCR仪中，哪位高人看下，体系还有什么需要优化的？返回小木虫查看更多

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精华评论

jerry110

我们是25微升的体系，但是酶只加0.5微升啊，不知道你们是怎样的，扩不出来可以调节一下其他的量
hclcarl

引用回帖:
Originally posted by hnndpt at 2010-12-27 09:18:21:
最近在扩增基因，用如下程序，扩好多次都没结果，只有引物2聚体，大家帮看下反应程序有无问题。

                  水： 12.2微升
                  10*buffer： 2微升
                  DNTP:2微 ...

应该把各种组分的浓度加上吧我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶
，
hnndpt

[quote]Originally posted by hclcarl at 2010-12-27 10:13:22:

应该把各种组分的浓度加上吧我们实验室用的是宝生物的Taq酶 25ul的体系加0.125ul的Taq酶 [/quote

我们用的酶是老板的同学实验室自己做的，所以浓度也不太清楚！
武荷花S

把各成分浓度标上
一般扩不出条带很大原因是模板和引物
如果是通用引物模板是否讲解
如果是自己设计的建议重新设计引物
hnndpt

引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2010-12-27 10:20:24:
把各成分浓度标上
一般扩不出条带很大原因是模板和引物
如果是通用引物模板是否讲解
如果是自己设计的建议重新设计引物

引物是根据已知的基因序列设计的，因为要克隆CDS序列，所以就在编码区两端设计引物，前加酶切位点和保护碱基。共9个基因设计了引物，55度退火扩增，一条带也没出来，请看一下引物浓度低吗？我扩出来只有引物2聚体，是否说明引物够用？我扩的长度9个基因都在1000-1500bp之间
hnndpt

引用回帖:
Originally posted by 武荷花S at 2010-12-27 10:20:24:
把各成分浓度标上
一般扩不出条带很大原因是模板和引物
如果是通用引物模板是否讲解
如果是自己设计的建议重新设计引物

另外我们的酶是自己做的，别人用来扩拟南芥400-600bp的片段可以扩出来，20微升体系加0.2微升，你看我这个酶是不是加的少了？
可可猫

我们也是25微升体系

酶只加0.2微升宝生物的taq酶