【求助/交流】关于基因敲除
最近在做大肠基因敲除，转化的是PCR产物，是DNA片段，2000Kb多点，转化后，平板上有菌落长出来，接摇瓶转化子也长，同样的抗生素浓度下转化前的菌株不长，这可以说明转化子表现抗性吧？但是验证PCR时，P出来的条带总是在一条线上，也就是说没有重组上，感觉很奇怪，不知道各位有没有遇到这种情况，这到底是什么原因，转化进去片段应该不会表达的吧？不知道我有没有把问题说清楚，请高手指教！！先谢过了！！
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也遇到同样的问题啊，做酵母基因敲除，转进了抗性基因，能耐受很高的抗生素浓度，PCR验证却做不出来。
做酶切验证，那是最准确的方法。另外，你PCR时应该做阳性对照，以验证是否是PCR的问题
PCR我做了一个未转化菌株的对照，P出来的条带和转化子P出的条带在在一条带上，我点样时加了一个Marker，结果是全部都没有到2000K，这个应该可以说明PCR没有问题的吧
，
你的pcr片段大小是不是和你要敲除的基因片段大小差不多？
不是的，，我是拿菌的全基因P的，这肯定不一样大的吧……
lz问题解决了没？我也遇到这样的问题了。。。
具体的比对一下你的基因片段大小和PCR产物的大小是否差不多吧，有的时候大小差别很少的。
也可以在你PCR产物的中间设计一个引物，这样做PCR的话，只有阳性的菌落才能P出来。