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关于pPIC9K载体克隆遇到的问题

江湖救急!有没有做过pPIC9K载体克隆的大神,为什么我的克隆总是不成功呢?   酶切之后跑电泳,片段正常,为什么就是连接不上去呢?做了好几次转化,每次都是一个菌都不长,很是头疼呀!!望有经验的大神能帮帮我,不甚感激!

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用户评论

你是怎么确定酶就一定把你的目的基因给切开的那?

2楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-17 08:07:59
你是怎么确定酶就一定把你的目的基因给切开的那?
跑电泳,起码质粒的形态不同了,成了条带状,而且用的是taraka的内切酶,不知我这样判断对不对?

3楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-17 08:43:16
跑电泳,起码质粒的形态不同了,成了条带状,而且用的是taraka的内切酶,不知我这样判断对不对?
...
不是质粒,是PCR产物的目的片段。

4楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-17 09:49:06
不是质粒,是PCR产物的目的片段。...
这个,我还真是没法判断。应该如何判断呢?我已经酶切过两次了,过夜切的~

你用的是哪两个酶切位点

6楼: Originally posted by dellxiong at 2017-05-17 17:11:35
你用的是哪两个酶切位点
EcoRI   NotI

7楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-17 21:15:56
EcoRI   NotI
...
我做过这俩位点的克隆,很顺利,你的问题主要是不长单克隆,你先转一个空载体pPIC9K到大肠杆菌,看能不能长出单克隆。(验证载体无误)

8楼: Originally posted by dellxiong at 2017-05-18 09:01:48
我做过这俩位点的克隆,很顺利,你的问题主要是不长单克隆,你先转一个空载体pPIC9K到大肠杆菌,看能不能长出单克隆。(验证载体无误)...
这个已经做过了,没有问题。应该算是正常的

首先保证片段的引物设计、PCR、酶切和回收没有问题。然后是载体是酶切和回收,最后是连接和转化。涉及的步骤、工具酶、抗生素和感受态都验证一下。

10楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-05-18 11:52:11
首先保证片段的引物设计、PCR、酶切和回收没有问题。然后是载体是酶切和回收,最后是连接和转化。涉及的步骤、工具酶、抗生素和感受态都验证一下。
我之前也做过其他载体的克隆,相关的过程也都差不多做的,所有的步骤都重新来过了,连感受态都重新做了一批,但是还是不行。用了Takara的连接试剂盒,这个和我之前单独用的T4不同,其他也都一样的。真是觉得很是头疼,不知问题出在哪了,

7楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-17 21:15:56
EcoRI   NotI
...
把载体和目的基因寄给我,5000块半个月帮你做出来

11楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-18 13:25:46
我之前也做过其他载体的克隆,相关的过程也都差不多做的,所有的步骤都重新来过了,连感受态都重新做了一批,但是还是不行。用了Takara的连接试剂盒,这个和我之前单独用的T4不同,其他也都一样的。真是觉得很是头 ...
在大肠杆菌中克隆不是很难

11楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-18 13:25:46
我之前也做过其他载体的克隆,相关的过程也都差不多做的,所有的步骤都重新来过了,连感受态都重新做了一批,但是还是不行。用了Takara的连接试剂盒,这个和我之前单独用的T4不同,其他也都一样的。真是觉得很是头 ...
你这两个酶我没有

7楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-17 21:15:56
EcoRI   NotI
...
你用的那两个酶我没有

11楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-18 13:25:46
我之前也做过其他载体的克隆,相关的过程也都差不多做的,所有的步骤都重新来过了,连感受态都重新做了一批,但是还是不行。用了Takara的连接试剂盒,这个和我之前单独用的T4不同,其他也都一样的。真是觉得很是头 ...
连接酶用什么应该问题都不大,拿一个以前的质粒做个转化涂个板看看。

16楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-05-18 15:14:07
连接酶用什么应该问题都不大,拿一个以前的质粒做个转化涂个板看看。...
已经做过了~空质粒能长起来

17楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-18 15:51:16
已经做过了~空质粒能长起来
...
那就是质粒本身了,向有关公司技术咨询一下吧

18楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-05-18 15:54:33
那就是质粒本身了,向有关公司技术咨询一下吧...
无奈~

胶回收后的浓度很重要,我之前就是浓度低连不上

20楼: Originally posted by 时光、过客 at 2017-05-19 20:09:29
胶回收后的浓度很重要,我之前就是浓度低连不上
我是跑的胶,感觉亮度还可以

去磷酸试剂盒

22楼: Originally posted by 小绯匣子 at 2017-05-21 11:34:41
去磷酸试剂盒
去磷酸化对连接影响大吗

你可以查一下,可以把目的片段和载体拿来出来一下在连接,可以提高链接转化效率,本人没用过

24楼: Originally posted by 小绯匣子 at 2017-05-21 13:13:32
你可以查一下,可以把目的片段和载体拿来出来一下在连接,可以提高链接转化效率,本人没用过
处理

有载体和基因我一定可以做出来

普通的双酶切和连接多做几次一定会成功

其它扯太远的建议都没必要

8楼: Originally posted by dellxiong at 2017-05-18 09:01:48
我做过这俩位点的克隆,很顺利,你的问题主要是不长单克隆,你先转一个空载体pPIC9K到大肠杆菌,看能不能长出单克隆。(验证载体无误)...
层主,如果转化后涂的板子长的菌特别多呢,菌液PCR却都不是。

您好,我做pPIC9的连接也一直不成功,请问您当时是怎么解决的呢?
谢谢!

30楼: Originally posted by sea4on at 2017-05-24 21:25:19
您好,我做pPIC9的连接也一直不成功,请问您当时是怎么解决的呢?
谢谢!
还没解决呢,正在尝试,保持联系呀

觉得你可以考虑用infusion 去做了

5楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-05-17 10:01:09
这个,我还真是没法判断。应该如何判断呢?我已经酶切过两次了,过夜切的~
...
我如果排除了其他因素,如T4DNA连接酶是好的,,抗性是好的,无法判断目的片段是否切动时,就把目的片段连到T载体上,在切下来。

33楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-25 08:24:50
我如果排除了其他因素,如T4DNA连接酶是好的,,抗性是好的,无法判断目的片段是否切动时,就把目的片段连到T载体上,在切下来。...
已经买了T载体,还没回来呢,T载体是不是直接把PCR产物连上去?

29楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 16:44:53
层主,如果转化后涂的板子长的菌特别多呢,菌液PCR却都不是。
...
这个有可能是酶切不彻底,建议过夜酶切

都是过夜切的,1ug载体我用3ul的酶去切的

推荐使用同源重组的方法

37楼: Originally posted by gw254404163 at 2017-06-01 23:37:51
推荐使用同源重组的方法
我没用过,怎么同源重组呢

你可以把pcr产物别酶切直接连T载,筛到阳性克隆后再酶切,把目的基因切下来,连接。判断载体有没有切好,可以将酶切好的载体,用水代替片段,加酶做连接转化,如果长得很多就证明载体没切好,长得比较少的话,可以将就着用。载体也可以试试分步酶切

38楼: Originally posted by guoxhyy at 2017-06-02 07:07:29
我没用过,怎么同源重组呢
...
利用线性载体两端和片段两端相同的序列,用同源重组酶,具体可在网上看看,近岸生物有个重组酶,很好用

我最近要做这个,质粒能不能给我点呀

连接体系有问题嘛?片段有多大?载体很大不好转化很正常.确保酶切,质粒去磷酸化,再试试

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