1引物是否是特异性引物，引物做blast ，2退火温度可以适当提高，3我也不知道了

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2楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-04-24 23:21:03
1引物是否是特异性引物，引物做blast ，2退火温度可以适当提高，3我也不知道了

引物是特异性引物，blast结果也只有目的片段（1.7kb），这对引物的退火温度是54和56，我试了52-62℃作为退火温度，都没有目的条带，难道还要再高一些

首先，PCR出来什么样的条带都不要奇怪。然后，没有目的条带不要单纯的从引物角度考虑，模板的量不宜过大，一般都觉得加大量容易扩增出来结果，实际不然。再，酶也很关键。最后就是基因本身结构的影响等，可能本身是块硬骨头。

引用回帖:

4楼: Originally posted by 贱贱JMe at 2017-04-25 15:30:53
首先，PCR出来什么样的条带都不要奇怪。然后，没有目的条带不要单纯的从引物角度考虑，模板的量不宜过大，一般都觉得加大量容易扩增出来结果，实际不然。再，酶也很关键。最后就是基因本身结构的影响等，可能本身是 ...

谢谢回复！PCR模板量我都是加1ul的cDNA，算正常量吧。
然后酶我还真没想过，我用的是pfu酶，实验室其他的人用的也是这种酶，克隆的时候没有出现我这种问题，不知道怎么回事。
最后基因本身结构方面，我研究的这种基因做的人还挺多的，文章也很多，但是做过表达的文章还真不多，我目前找到的几篇文献中使用的这个质粒还都是同一个实验室做的，所以我也在想是不是这个基因本身就比较难扩，但是这个质粒真的对我很重要，是一定得做出来的，大神你看要是这种不好扩增的基因怎样才能扩出来？有什么特殊的方法吗
，

试试分几个片段来做融合，我也遇到同样的问题，现在我的是片段都P出来了，但是连不上- -

片段有点偏长，需要cDNA质量足够好，凝胶上有非特异带，也有引物二聚体，所以目前的引物扩增效果比较差。建议放弃目前的引物，重新设计退火温度在60度左右的引物，进行试验。另外要分析一下片段中是否有特殊序列，比如高GC含量序列，如果有，可以考虑加入辅助试剂，希望对你有帮助。

延伸时间是多少呢？好像pfu是600bp/s