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求助蓝白斑筛选的相关问题

我涂的板为什么会培养基都变蓝色,而且也没有多少白菌,挑一两个看似白菌的菌落再划线到新制的含氨变青霉素,x-gal,IPTG的平板上结果都又是蓝色,想知道是什么原因,有木有人能给解释一下,谢谢!
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用户评论

用JM109菌株,不要用BL21或者MG1655

蓝白斑的原理是α互补。JM109的LacZ基因缺少α片段,因此,不能分解x-gal显蓝色。质粒载体上有完整的α基因序列,多克隆位点也在这段序列内

如果在这个位点插入了外源片段,将会破坏α阅读框,这种破坏大部分情况下会造成α基因失活。如果没有插入外源基因,α片段就可以表达,使得基因LacZ组装完整,分解x-gal显蓝色

出现大片的蓝斑,一是可能根本没连上外源片段,全是自连接。二是插入的片段未能使α基因失活,虽然正确插入了,却依然是显蓝斑,这种情况一般常见于插入片段小于500bp,但是也有报道插入2000bp也依然无法失活α片段,显蓝色。

第三种,就是你用了LacZ基因完整的菌株,例如BL21,MG1655。这些菌株的LacZ基因是完整的,只要有诱导剂和显色剂,就会显蓝色

排除第三种,直接把菌株涂布在IPTG和x-gal上,看是否显色

排除第一种,直接不要加片段,转化空载体,看是不是因为载体自连接效率太高导致的。

排除第二种,直接用通用引物做一下菌落pcr,跑胶看一下大小就行了

看你的平板长得这么浓密,载体根本没切开的可能性最高。换新酶,切一下就好了。切完跑一下胶,单条带才对。没切开的环状质粒至少有两条带。

还有,你的平板那么集中,涂板也没涂开

蓝色集中,可能是在平板上涂布的x-gal,应该在倒板时,待培养基不烫手时,加amp,IPTG,x-gal,混匀后倒板,才会均一。另外貌似x-gal加多了,再确认一下浓度。

12楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2017-04-18 12:04:05
蓝色集中,可能是在平板上涂布的x-gal,应该在倒板时,待培养基不烫手时,加amp,IPTG,x-gal,混匀后倒板,才会均一。另外貌似x-gal加多了,再确认一下浓度。
x-gal是参照说明书上2mg/ml配的加了100ul涂布,感受态用的dh5а

12楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2017-04-18 12:04:05
蓝色集中,可能是在平板上涂布的x-gal,应该在倒板时,待培养基不烫手时,加amp,IPTG,x-gal,混匀后倒板,才会均一。另外貌似x-gal加多了,再确认一下浓度。
另外我用混匀的方法倒平板也是出现这种蓝色

13楼: Originally posted by cutepigxia at 2017-04-18 12:19:52
x-gal是参照说明书上2mg/ml配的加了100ul涂布,感受态用的dh5а
...
x-gal是20mg/ml,即2%

你涂的太多了,菌落长不大,也挑不到单克隆。

涂布技术不过关,或者平板没晾干,或者涂太多,或者没有涂开,或者涂了没有吹干没有倒置平放。

13楼: Originally posted by cutepigxia at 2017-04-18 12:19:52
x-gal是参照说明书上2mg/ml配的加了100ul涂布,感受态用的dh5а
...
x-gal用DMF溶解到20mg/mL,然后按照培养基体积千分之二添加的。不是涂布。

15楼: Originally posted by cutepigxia at 2017-04-18 12:34:35
x-gal是20mg/ml,即2%
...
你确定是DH5α?我觉得你应该做一下空白对照。

19楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2017-04-19 19:06:18
你确定是DH5α?我觉得你应该做一下空白对照。...
嗯我昨天做了空白对照,感觉感受态细胞不太对,没进行转化的感受态细胞涂板出现了蓝色,你说的那个加体积的0.2%x-gal是参照什么书籍来的?

20楼: Originally posted by cutepigxia at 2017-04-19 21:51:36
嗯我昨天做了空白对照,感觉感受态细胞不太对,没进行转化的感受态细胞涂板出现了蓝色,你说的那个加体积的0.2%x-gal是参照什么书籍来的?
...
换一株新的DH5α,或者JM109,重新做感受态。记得先划线确认没问题了再做感受态。至于x-gal,参照《分子克隆实验指南》

1.加入氨苄的量可能太少了,浓度不够,无法合理抑制菌株生长2.上样量太多,无法均匀涂开;培养时间过长3.排除外界条件,目的基因未能成功连接到载体上

21楼: Originally posted by 小松鼠45 at 2017-04-19 22:05:48
换一株新的DH5α,或者JM109,重新做感受态。记得先划线确认没问题了再做感受态。至于x-gal,参照《分子克隆实验指南》...
嗯好的,谢谢!

22楼: Originally posted by 泰迪犬 at 2017-04-20 10:29:42
1.加入氨苄的量可能太少了,浓度不够,无法合理抑制菌株生长2.上样量太多,无法均匀涂开;培养时间过长3.排除外界条件,目的基因未能成功连接到载体上
好的,谢谢你的建议!

全蓝的原因:ta克隆失败,发生了自连,形成完整的lacz片段,从而分解x-gal形成蓝色;部分白斑再次涂板变蓝原因:第一次涂x-gal的时候不均匀,建议在培养基50-60摄氏度的时候直接加入x-gal(多点没事),锥形瓶不离台面,摇匀。再倒平板。然后再继续后面的工作。

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