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TAKARA T4 DNA Ligase使用

TAKARA T4 DNA Ligase使用问题:PET28a和基因连接,T4 DNA Ligase和Buffer用量多少呢?
   10微升体系:载体1,基因6,连接酶1,buffer1,水1和载体1,基因6,连接酶0.5,buffer1,水1.5。两都试过了,连不上。
   求大神解答。

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用户评论

连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题

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2楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-03-17 15:41:16
连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题
感谢回答。之前做得载体和基因比例都是1:6,今天再做一次1:3的,看看能不能连上。

我们最近也在做连接,我们的体系是25微升,我觉得载体根据浓度还是尽量少加点,我们也一直连接效率非常低,阳性克隆非常少,你需要验证下是不是连接酶是不是有问题。

你怎么确定没连上,筛选是个很重要的步骤

28a是低拷贝 首先说下体系载体1.5  基因6  10??buffer 1  水0.5 酶0.5       16度水浴4到6hr

我刚开始的时候也像你一样迷茫,同学给我推荐了小木虫APP,上面很多牛人分享的科研经验,对新手很有帮助,你也可以下载来试试!

水1  我们的比例一般在1比3和1比6之间    当然不排除有的基因确实不好连

5311  片段质粒buffer酶,每次都成!

5楼: Originally posted by Liumengya at 2017-03-17 23:43:19
你怎么确定没连上,筛选是个很重要的步骤
转化完了蓝白斑筛选没长菌。

4楼: Originally posted by jcstone1027 at 2017-03-17 22:39:21
我们最近也在做连接,我们的体系是25微升,我觉得载体根据浓度还是尽量少加点,我们也一直连接效率非常低,阳性克隆非常少,你需要验证下是不是连接酶是不是有问题。
连接酶是新的,我刚打开的。载体也是酶切完了,已经切开的和未切开的跑了张图,确定了载体也切开了的。

8楼: Originally posted by huxi_8 at 2017-03-18 01:47:48
5311  片段质粒buffer酶,每次都成!
嗯,谢谢,如果这次不成我试试

7楼: Originally posted by 都从新来过 at 2017-03-18 00:11:09
水1  我们的比例一般在1比3和1比6之间    当然不排除有的基因确实不好连
感谢回答。这次用的载体基因1:3,不知道能不能连上。

6楼: Originally posted by 都从新来过 at 2017-03-18 00:09:03
28a是低拷贝 首先说下体系载体1.5  基因6  10??buffer 1  水0.5 酶0.5       16度水浴4到6hr
我一直都是16度水浴过夜啊。

过夜一般是冰箱4度

14楼: Originally posted by 都从新来过 at 2017-03-19 00:47:15
过夜一般是冰箱4度
你用的是TAKARA T4 DNA LIGASE 2011A吗?我看说明书上要求16度过夜啊

8楼: Originally posted by huxi_8 at 2017-03-18 01:47:48
5311  片段质粒buffer酶,每次都成!
你用的是TAKARA T4 DNA LIGASE吗?10倍的buffer?

先片段和质粒酶切回收后各跑一微升电泳看看 片段多大?


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