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TAKARA T4 DNA Ligase使用

TAKARA T4 DNA Ligase使用问题:PET28a和基因连接,T4 DNA Ligase和Buffer用量多少呢?
   10微升体系:载体1,基因6,连接酶1,buffer1,水1和载体1,基因6,连接酶0.5,buffer1,水1.5。两都试过了,连不上。
   求大神解答。
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用户评论

连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题

2楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-03-17 15:41:16
连接时比较关键的是载体和目的片段的比例  连接酶的话0.5微升就可以
所以我觉得连不上应该不是连接酶的问题
感谢回答。之前做得载体和基因比例都是1:6,今天再做一次1:3的,看看能不能连上,

我们最近也在做连接,我们的体系是25微升,我觉得载体根据浓度还是尽量少加点,我们也一直连接效率非常低,阳性克隆非常少,你需要验证下是不是连接酶是不是有问题。

你怎么确定没连上,筛选是个很重要的步骤

28a是低拷贝 首先说下体系载体1.5  基因6  10??buffer 1  水0.5 酶0.5       16度水浴4到6hr

水1  我们的比例一般在1比3和1比6之间    当然不排除有的基因确实不好连

5311  片段质粒buffer酶,每次都成!

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