我做成骨方向，是裂解C2C12细胞，然后用Western Blot分析细胞内pSmad1/5/8蛋白的含量。我计算了一下我跑胶的上样量大约45ug，然后按我们实验室前辈们摸索出来的经验，恒电压80V至跑出条带，然后换100V跑，整个过程大约90min。pSmad分子量大约在60kDa,我用的内参GAPDH在36kDa，于是转膜我用300mA转70min，感觉转的挺好的。接下来我用5%BSA室温封闭3h，然后加入1:1000的一抗4度孵育过夜，第二天吸出一抗用TBST洗三遍，每次5min，然后加入1：1000二抗室温孵育2h，然后用TBST洗三遍，每次5min，接下来就用ECL显色剂显色了，可是我跑了好几次感觉都不一样。。。
附件1是我上次跑的pSmad有一条，附件2是我这次跑的居然有3条。。。要哭了，有谁可以解释一下吗？


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