初步接触ELISA实验，最近以不同浓度的PCT抗体（鼠抗）（空白、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）包被酶标板（高吸附），封闭、洗涤等步骤后，加入不同稀释度的HRP羊抗鼠IgG，建议稀释度为1:3000，因此选1:2000、1:3000、1:4000作为不同梯度进行实验。后续加入TMB显色液、终止液后，OD值结果如附件图所示。
具体实验操作如下：

1. 不同浓度的PCT抗体（PBS缓冲液），均取100微升包被于96孔板中，4℃过夜；

2. PBS洗涤3次（300μl），每次3min (但由于没有300微升的排枪洗头，所以一个孔一个孔加的，所以可能不只浸泡3min,不知会不会有影响)。后封闭（2%BSA的PBS溶液）37℃下2h;

3. PBST（0.05% Tween 20的PBS溶液）洗涤5次（300μl），每次3min，拍干；

4. 加入HRP羊抗鼠IgG，不同稀释度（1:2000、1:3000、1:4000）（稀释液为PBST），每孔100μl，37℃孵育1h;

5. PBST（0.05% Tween 20的PBS溶液）洗涤5次（300μl），每次3min，拍干；

6. TMB显色液，每孔100μl，37℃1h;

7. 加入2M 硫酸，每孔50μl，室温静置5min后于酶标仪中450nm波长下检测OD值；

        因为是第一次做ELISA实验，本次实验是打算通过不同抗体稀释度包被，获得具有一定比例的OD值，验证实验操作无误并获得抗体浓度与HRP标记抗体的关系。后续打算再进行包被PCT抗体-PCT抗原-HRP羊抗鼠IgG，通过与上述实验对比，通过OD值的下降验证包被PCT抗体-PCT抗原的结合；最终再利用棋盘滴定法，通过包被PCT抗体-PCT抗原-HRPPCT抗体获得优化的抗体浓度。不知自己的实验思路合不合理？

        同时，从此次实验结果上看：

1. 空白处OD值是不是理应在0.1以下，我这个这么高的值正常吗？实验可以看出显淡黄色；

2. 随着抗体浓度增加，OD值先下降在上升，而且幅度很小，几乎看不出太大变化；

3. 随着HRP抗体稀释度变大，OD值也无明显变化；

不知是什么原因导致的。想请各位专家大神给些指导，感激不尽！谢谢！


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