求助大神,分子基础薄弱 引物设计扩不出来!
我的目的基因序列TTGGACAACGCCTTCCCCTTCGGGACATGCATCAACACGTCCGTCATCCAGAAGCCGGCCTTCCTCGACTTCTTCACCAACCACTTCGACTGGGCCGTCTTCGAGAACGAGCTCAAGTGGTACCACACGGAGGTGCAGCAGGGCCAGCTCAACTACGCCGACGCCGACGCGCTGCTCGCGTTCTGCGACCGCCTGGGCAAGACCGTCCGCGGCCACTGCGTCTTCTGGTCCGTGGACGGCGACGTGCAGCAGTGGGTCAAGAACCTCAACAAGGACCAGCTCAGGTCCGCCATGCAGAGCCGCCTCGAGGGCCTCGTCTCCCGCTACGCCGGCAGGTTCAAGCACTACGACGTCAACAACGAGATGCTGCACGGCCGCTTCTTCCGGGACCGCCTCGGCGACGAGGACGTCCCGGCGTACATGTTCAAGGAGGTGGCGCGGCTGGACCCGGAGCCCGTGCTCTTCGTCAACGACTACAACGTGGAGTGCGGCAACGACCCCAACGCGACGCCGGAGAAGTACGCCGAGCAGGTCGCATGGCTGCAGAGCTGCGGCGCGGTGGTGCGCGGCATCGGGCTGCAGGGCCACGTGCAAAACCCGGTCGGGGAGGTCATCTGCGCCGCGCTCGACAGGCTCGCCAAGACGGGGGTGCCCATCTGGTTCACCGAGCTCGACGTGCCGGAGTACGACGTGGGCCTCCGCGCCAAGGACCTGGAGGTGGTGCTCCGGGAGGCGTACGCGCACCCGGCCGTGGAGGGCATCGTGTTCTGGGGCTTCATGCAGGGCACAATGTGGCGCCAGAACGCTTGGCTCGTCGACGCCGATGGCACCGTCAACGAGGCGGGCCAGATGTTCCTGAATCTGCAGAAGGAGTGGAAG
设计的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位点 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1
R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7
前后引物均加酶切位点和保护碱基 尝试过退火温度58-64均没有P出来目的条带还尝试过55度也没有p出来 不知道是什么原因
求各位大神指点,小妹不胜感激! 返回小木虫查看更多
设计的引物 F:5' AGACCG GAATTC CGGACC TTGGACAACGCCTTC 3' 酶切位点 EcoRI GC含量57.6% TM值70.1
R:5' ATT GCGGCCGC TTA TCA CTTCCACTCCTTCTGC 3' 酶切位点 NotI GC含量54.5% TM值68.7
你的引物设计的有问题 比如说R:5端 加酶切位点前后都加了保护碱基 ,而且你的保护碱基貌似也不对,有相应的表的,http://wenku.baidu.com/link?url= ... wp-DAwczvXc81arqjsy;
我感觉可以设计成这样R:5- AAGGAAAAAAGCGGCCGC CTTCCACTCCTTCTGC 3-;同理F也一样。
另外注意 (1)酶及其浓度;
(2)模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一;,