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包涵体纯化重复性差

求助:本人目的蛋白大小14kd,his tag,含二硫键,表达在包涵体里。现在已经做过几次纯化,先用超声破碎,在超声洗涤3次,再用6M盐酸胍溶解,再稀释复性,透析除去盐酸胍,透析时间3~4天,在上镍柱纯化。现在纯化最高做出来1mg/ml的,但是很不稳定,有几次高点,后来再做就做不出来高浓度的了。重复性很差。我每次都做SDS-PAGE,前期包涵体处理应该没有啥问题,每次都差不多,后面纯化的SDS-PAGE显示蛋白挂柱的情况不好,我估计是复性这个环节出了问题,我做包涵体复性做的少,不知道这中间哪个步骤出了问题,想请教坛子里的大神们,帮忙分析下原因,那个环节有问题会导致后面纯化的浓度低。谢谢啦

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用户评论

2楼: Originally posted by 415881168 at 2017-01-11 14:53:24
:hand:
同道中人?

我的复性液中加了L-Arg,这个对后面的挂柱是不是有影响?
大神们help

你复性时间3-4天  是不是时间太长了?一个白天加一晚上过夜不够吗?

稀释复性,稀释多少倍,体积多少。透析3-4天,有什么依据吗,一般一天一夜换液3次足足够了

6楼: Originally posted by XMC-7 at 2017-01-13 08:37:44
稀释复性,稀释多少倍,体积多少。透析3-4天,有什么依据吗,一般一天一夜换液3次足足够了
50,或者100ml包涵体溶液稀释到1L复性液中,10-20倍。透析短了怕透析的不透彻。L-ARG对后面的挂柱会不会有影响?这次重新调整了复性液,把精氨酸去掉了,加了gly,但是效果还是不好,复性过程中就出现絮状沉淀了,是不是复性失败了?

顶顶顶,不要沉

一定要用盐酸胍啊?试过尿素没?我是很不喜欢用盐酸胍的,即使用,也可以摸摸用低一点的浓度试试能不能溶解,不一定要用到那么高。

9楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-13 14:28:50
一定要用盐酸胍啊?试过尿素没?我是很不喜欢用盐酸胍的,即使用,也可以摸摸用低一点的浓度试试能不能溶解,不一定要用到那么高。
我基本上都用盐酸胍,溶解性好,尿素用过,后来还是换了盐酸胍

顶顶顶,不要沉

顶顶顶,不要沉

复性过程中产生沉淀有时候是没办法避免的  建议你复性时间不要那么长

楼主有你这个方法的详细步骤吗?

变性后先用镍柱纯化  然后把基本纯的蛋白复性   能增加点复性率吧

用脲不能溶吗,用脲溶解后上柱纯化再透析啊