你先确定有没有你的目的带，有的话你做一个退火温度的梯度，或者尝试一下降落pcr,如果不行的话，你需要更换引物，。

引物量太多了吧

为什么要加那么多引物，，我一般加体系的十分之一，试引物的话，我觉得做梯度省事些

你的引物加的太多了，下面那条明亮的带估计是引物二聚体。

感觉引物量好多  我25ul体系只加了0.75ul（10uM) *2

1、引物加多了，20ul体系， 引物的总浓度为1uM ，你试试每对引物加1ul
2、做一个退火温度，梯度。  如果p不出来，就换引物了

第一，体系中引物加太多；第二，若降低引物量后还不出来，试着同时减少模板的量；第三，（在设计引物时就考虑过的）再检查一下引物的特异性，确保不是源头的错误；第四，梯度PCR，找到合适的退火温度。分别试一下这些方法，祝早日成功。

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