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PCR扩增条件摸索

本人用PUC19的模板扩增100bp片段,以前扩的都很好,最近突然就扩不出来了,没有100bp带,而且条带都是弥散的。后来将酶量减少,能扩出来了,但是第二天同样的条件又没有结果了(没有100bp片段且条带弥散),请教一下高手到底是什么原因?  返回小木虫查看更多

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用户评论

......诡异,建议LZ发BB攒人品。
考虑一下是不是模板的问题,比如反复冻融导致模板降解了。也许你那个弥散的条带是引物二聚体?

我的模板是新配的第一次还好用,-20度冻存一晚第二天用应该没关系吧   弥散的条带在400-800bp左右,比引物二聚体大,应该不是

这个确实有够诡异啊。
要不来次彻底的清理,工作地点该灭菌的灭菌,该清理的清理。提取DNA的试剂重新配制,然后再试试啊。
我以前也是这样啊,然后彻底从头再来,现在结果还是比较稳定。

出现这种情况可以说你的扩这个的PCR条件还不够优化,所以会出现结果不稳定的情况。。这种现象不诡异,确实是因为条件还不是最好的,所以实验中还有很多因素会成为决定实验结果的主要因素,比如操作多振荡了一下,等等。。
所以,仍需再摸下条件。。你的体系和反应条件温度是怎样的?

我前一段时间也遇到过类似的情况,一直找不到是什么原因,后来把模板还有所有PCR用的东西都换了,就p出来了

同样的试剂,我换了个可以扩500bp的引物和100bp的引物一起进行PCR,在同一个机器上用相同的程序运行,结果500bp的条带非常好,100bp的还是全部弥散。
我目前已经换过很多个模板而且稀释不同倍数,改变酶的加入量,使用不同的酶,改变引物加入量,结果都不行,我都快疯了。。。。
体系如下:
dNTP(10nM) 1ul
引物F          2ul
引物R              2ul
模板           1ul
Taq                 1ul
10*bf              5ul
水          至50ul,

94                  3min
94                 30s
54                  30s
72                 30s
72                10min
38 cycles

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