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PCR问题求助?

在设计引物预作PCR时,如果目的基因的mRNA长3000bp,那么设计引物的时候使扩增片段位于什么区间有没有什么不同呢?比如,位于1-1000bp间,1000-2000bp间,2000-3000bp间,扩增的效果会不会有什么大的区别呢?恳请有经验的虫友解答一下。谢谢!

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用户评论

应该没有吧。

引物设计一般依照引物退火温度,产物退火温度,还有引物结构,有没有二聚体等条件,建议你用一些软件如Oligo,Primer Premier等来设计

肯定是有区别的,3000BP的片段,一定会有二级结构的。如果你刚好设计在二级结构上的话,退火温度肯定要高一些。还有就是取决于你的逆转引物是什么,OLIGODT是从POLYA开始的,可能会由于二级结构的阻碍导致逆转不彻底,那么设计在上游例如1-500范围内,有可能扩增不成功。:):):)

这个肯定是有区别的啊,但是有多大就不好说了。楼上二位说的挺好啊,你完全可以摸索一下啊

建议1 不要设计在5‘或者3'端,因为在这两段往往涉及RNA Processing°radation的特殊结构,设计在这些位点可能会造成PCR不成功,偏中间的序列往往比较保险,建议在各个区段各设计一对,看哪对能P出来。3K也不是很长,不会特别难做。

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