小木虫 --- 600万学术达人喜爱的学术科研平台

首页 >> 生物科学 >>查看话题

关于基因敲除

小弟,最近要做乳酸菌里的基因敲除,想用puc18为敲除载体,在上面构建同源臂,采用双交换的方法进行打靶,但是不知道puc18能否在我的乳酸菌里复制,如果能够复制的话我就没办法进行抗性筛选了,期待各位大虾的帮助

相关话题

用户评论

puc18......不太清楚,应该能吧?
但是敲除还是可以做,比如转化之前先用酶切的方法使质粒线性化,这样转化进去后,如果没有发生同源重组就不能表达抗性了,即使有少量的瞬时表达,多传代几次就筛掉了。

但是线性片段是很难做敲除的,在宿主细胞内很快就被降解掉了,所以现在大部分细菌是采用质粒转化敲除的啊

你可以找个自杀质粒或温敏质粒,puc18的话一定要先线性化了,然后再转进受体菌株!有问题的话可以大家讨论讨论。我也再做敲除!

我的qq383144137,方便的话加我好吧

敲除德兄弟们啊.....说说经验

可以很负责任的告诉各位 我以前的想法是错误的 大家不要被我所误导啊

楼主所说的什么想法是错误的?

即使发生了但交换 也没有办法进行第二次交换的筛选

Originally posted by huangdi07 at 2009-09-09 14:08:19:
小弟,最近要做乳酸菌里的基因敲除,想用puc18为敲除载体,在上面构建同源臂,采用双交换的方法进行打靶,但是不知道puc18能否在我的乳酸菌里复制,如果能够复制的话我就没办法进行抗性筛选了,期待各位大虾的帮助
想知道楼主最后基因敲除成功了没有?用的是什么方法呢?

楼主加我QQ464709745,想向你请教一下如何在乳酸菌中做基因敲除

:hand::hand:

线性化质粒确实是最简单的选择

构建同源臂不是要让它发生交换么 还复制有什么用 啊

17555984楼: Originally posted by liumiao05 at 2011-09-30 10:02:56:
求解释
转化效率太低了,双交换同时发生,菌株本身的转化效率很低,线性转化几乎都被分解掉了

:hand::hand:

您好,请问,您现在弄白PUC18能否在您的乳酸菌里复制!?