怎么没人回答我呢？

首先，应该和你讨论的是：你放入-20度的环境保藏菌种，并不是很好。最好用液氮保藏或者-70度的冰箱的保藏，菌种比较稳定。
其实，菌种的活化步骤如下：
第一天：
1、放入4℃，一直到变成液状；（用液氮保藏直接放入37度的温水中，待变成液体 状，直接划线培养）
2、制备固体培养基，灭菌后，在超净工作台进行以下操作：
3、制备液倒入无菌培养皿，每培养皿约25ml；
4、待凝固后，用接种环，划板；
5、水平放置半小时以上，待菌吸附在培养基上。
5、用保鲜膜或者封口膜密封培养皿，倒置于37℃恒温箱中过夜；
第二天：
6、制备150mL液体培养基，灭菌后，在超净工作台进行以下操作：
8、挑平板上单个菌落，至液体培养液中，200rpm摇床过夜；

这样培养的菌液放入4度冰箱，可以在一周内做后续的实验。但是超过一周，就别用了。还有上述的平板放到4度的冰箱里，可以在两周内重新扩大培养成菌液。但是超过2周，就别用了，活性和特性都不稳定，

放-20有可能冻死了……
如果是-80拿出来的，其实，真要是直接丢到有抗性的液体培养基也是能够活化的
细菌没那么脆弱
当然如果你是什么需要产什么蛋白的菌，就最好按照普通LB平板划线挑形态ok的单克隆分步扩增
我只是用来存质粒的，属于克隆宿主，所以我每次都不管直接丢加了抗性的培养基摇，照样做实验

如果你该管还想继续保存,有管内菌未解冻的情况下,接种环烧红后立即伸处管中,后于平板划线。最好于-70度保存

平板于培养箱按你的菌要求培养